2025, Vol. 55
2. 青岛海洋科技中心海洋生态环境科学功能实验室，山东 青岛 266237;
3. 中国海洋大学环境科学与工程学院，海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100;
4. 中国海洋大学深海圈层与地球系统前沿科学中心, 山东 青岛 266100
随着塑料制品的广泛使用，塑料垃圾的产量也在逐年升高，预计2050年全球将有120亿t的塑料垃圾被排放到自然界中[1]。环境中的塑料在化学、生物和物理等作用下被分解为微塑料(Microplastics，MPs)，即粒径小于5 mm的塑料颗粒[2]。目前，微塑料污染已经在水体[3]、土壤[4]和空气[5]等各种环境介质中被检出，甚至在深海沉积物[6]和极地地区[7]也都有分布，对环境中的生物具有很大的潜在危害。
微藻是水体环境中的初级生产者，对生态系统的平衡起着至关重要的作用，因其生命周期短且对环境敏感性高，常被用作测定污染环境的指示生物[8]。现有的研究表明，MPs会影响微藻的能量代谢和光合作用，使其产生氧化应激反应[9]，这可能是由于MPs对微藻产生遮蔽效应和物理损伤，并且两者之间的吸附作用会产生异质聚集[10]。MPs对微藻的影响同微藻的种类、粒径大小和浓度等均有关。Ye等[11]研究了4种粒径(0.2、0.5、1和5 μm)的5 mg/L聚苯乙烯微塑料(Polystyrene microplastics，PS-MPs)对12种微藻的毒性效应，结果显示，0.5和1 μm的PS-MPs对微藻生长的抑制率最高，并且微藻细胞越大，抑制率越高。Xu等[12]将3种海洋微藻和2种淡水微藻分别暴露于含有0、10、103和105个/L的50 μm粒径的PS-MPs环境中，与实验24 h时相比，96 h时海洋微藻的氧化应激反应有所缓解，而淡水微藻的抗氧化系统仍处于较高水平，表明淡水微藻受到的影响更为严重，这可能与它们不同的膜结构有关。在MPs的粒径范围内，作为粒径小于1 μm的纳米塑料(Nanoplastics，NPs)在环境中的数量更为丰富，且与其他污染物和生物的反应更加复杂，另外，由于其体积微小，因此更容易进入到活细胞中[13]。Yan等[14]的研究结果证明，100 nm的PS-NPs对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)生长和抗氧化系统的影响大于100 μm的PS-MPs，且PS-NPs会内化进入藻细胞内。因此NPs对微藻的影响可能更为严重，有必要对NPs对微藻的毒性效应进行深入探讨。
东海原甲藻是中国东海海域常见的优势藻种，直径为16~22 μm[15]。该藻是历年来东海特大赤潮的主要肇事种，在海洋环境保护与生态安全研究中具有非常重要的地位。在当前MPs污染逐渐增强的背景下，研究NPs对其毒性作用对于了解该藻的种群增长规律及其在群落演替中的作用具有重要意义。本研究将不同浓度的NPs作用于东海原甲藻，从细胞层面(如藻细胞密度、抗氧化酶活性和细胞凋亡率等)和转录组分子层面探讨NPs对东海原甲藻的影响，旨在为探究纳米塑料对微藻的毒性效应提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料本研究所用的100 nm的聚苯乙烯(Polystyrene，PS)微球悬浮液(2.5%，w/v)购自海安智川电池材料科技有限公司，实验使用前，对悬浮液进行30 min的超声处理以使其充分分散，分散介质为超纯水。实验过程中，使用激光粒度分析仪和扫描电子显微镜(Scanning electron microscopic, SEM)对PS微球的大小和形状进行表征。
1.2 微藻培养与处理实验所用东海原甲藻分离自东海藻华暴发区。实验海水使用配置的人工海水(盐度为32~33)，经0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤，并在121 ℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min，冷却后添加L1培养基。将东海原甲藻置于温度为(20±1) ℃、光暗比为12 h∶12 h、光照强度为120 μmol·m-2·s-1的条件下培养至指数生长期，以备后续实验使用。
培养容器为已灭菌的2 L三角烧瓶，培养体积为1 L，共设置3个浓度的PS-NPs处理组，向海水中加入对应量的PS微球。根据现有研究，当今和未来较长时间内环境中NPs的浓度将维持在1×1011~1×1014个/L[16]，因此本研究将PS-NPs浓度设置为0.1、1和10 mg/L(对应的数量浓度分别为1.9×1011、1.9×1012和1.9×1013个/L)。将加入PS微球后的溶液超声振荡30 min，以不添加PS-NPs的培养液为对照组。接入适量的东海原甲藻细胞，使其初始藻细胞密度为1×104 cells/mL，每组设置3个平行样，每日定时摇晃培养瓶。
1.3 藻细胞密度测定从培养的第1天开始，每天取1 mL藻液样品，用鲁戈试剂固定后，使用浮游生物计数框在光学显微镜(品牌型号：Olympus BX51)下计数，以获得细胞密度。
1.4 活性氧测定细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)使用Solarbio® 2′, 7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)活性氧ROS荧光探针测定。具体操作步骤如下：首先，使用0.8 μm的醋酸纤维滤膜对藻细胞进行收集，用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)对其进行洗脱；其次，向藻细胞中加入染料，于37 ℃条件下避光处理15 min；然后，以6 500g离心7 min，弃掉上清液；随后，用预热的PBS缓冲液洗涤2次后，再次加入预热的PBS缓冲液，于37 ℃条件下避光孵育15 min；最后，设置不添加染色剂的样品作为阴性对照，用流式细胞仪(BD AccuriTM C6 Plus)进行活性氧含量的测定。
1.5 抗氧化酶和丙二醛含量测定使用Solarbio©超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒和过氧化氢酶(Catalase，CAT)检测试剂盒对东海原甲藻抗氧化酶活性进行测定，使用南京建成生物工程研究所生产的丙二醛测试盒对东海原甲藻丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量进行测定。
1.6 细胞凋亡分析细胞凋亡情况通过测定细胞内磷脂酰丝氨酸外翻细胞百分比来评估，使用Solarbio®膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，ANNEXIN V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒对其进行测定。具体操作步骤如下：首先，使用0.8 μm醋酸纤维滤膜对藻细胞进行收集，加入1 mL 4 ℃预冷的PBS缓冲液，重悬藻细胞；然后，通过离心沉淀细胞弃去上清液后，用1×Binding Buffer再次悬浮细胞，调节细胞密度在1×106~5×106 cells/mL；最后，依次加入FITC和PI染料，轻轻混匀后，立刻使用流式细胞仪进行检测。
1.7 RNA提取和转录组分析在实验第7、13和17天收集样品，对应东海原甲藻生长的指数期(Exponential phase，EP)、稳定期(Stationary phase，SP)和衰亡期(Decline phase，DP)。样品收集时，经0.8 μm的醋酸纤维滤膜过滤，再用PBS洗脱并去上清，然后迅速置于液氮中15 min，随后将样品放在-80 ℃冰箱保存。总RNA的提取以及Illumina NovaSeq 6000双端测序委托南京派森诺基因科技有限公司完成。
对原始下机数据FASTQ文件进行处理：首先，使用Cutadapt软件进行过滤，以去除带接头、长度小于50 bp和序列平均质量在Q20(测序过程的碱基识别中，对所识别的碱基给出的错误概率为1%)以下的读长(Reads)；其次，对得到的高质量序列进行从头拼接，从而得到转录本序列；然后，对转录本进行聚类，挑选最长的转录本作为Unigene进行后续KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)和GO(Gene ontology)注释；接着，将过滤后的序列比对到Unigene上，得到每个Unigene的Reads数；最后，在此基础上对样品进行表达差异分析和富集分析，其中基因表达分析采用DESeq软件(筛选差异表达基因的条件：表达差异倍数|log2(Fold change)|>1且显著性P＜0.05)。
1.8 数据分析对实验得到的数据进行处理，并用Origin 2024软件进行可视化。使用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，检验对照组与处理组之间的统计学差异。
2 实验结果 2.1 PS-NPs的表征SEM图像(见图 1(a))显示，PS呈球状且大小均匀，微球粒径约为100 nm；粒径分布图(见图 1(b))显示，PS微球的平均粒径为(0.103 ± 0.001) μm。SEM观察结果和激光粒度分析仪测定结果一致，说明所制备的PS-NPs具有良好的均一性，可作为本实验的目标污染物。
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图 1 聚苯乙烯纳米塑料的SEM图像(a)和粒径分布情况(b) Fig. 1 SEM image (a) and particle size distribution (b) of polystyrene nanoplastics |
整个培养周期内，东海原甲藻的生长进程大致可以分为四个时期(见图 2)：迟滞期(第1—3天)、对数生长期(第3—11天)、稳定期(第11—15天)和衰亡期(第15—17天)。暴露后第5—17天，3个PS-NPs组的藻细胞密度均低于对照组；第5—9天，0.1和1 mg/L PS-NPs组同对照组之间存在显著差异(p＜0.05)；第5—13天，10 mg/L PS-NPs组显著低于对照组(p＜0.05)，说明东海原甲藻在各实验浓度PS-NPs胁迫下生长均受到了抑制，同时，0.1 mg/L PS-NPs组的藻细胞密度均略高于1 mg/L PS-NPs处理组，但仅在第9天具有显著差异(p＜0.05)；第7—13天，10 mg/L PS-NPs组的藻细胞密度显著低于0.1和1 mg/L PS-NPs组(p＜0.05)，说明10 mg/L的PS-NPs对东海原甲藻生长的抑制作用强于0.1和1 mg/L PS-NPs组。分析各PS-NPs浓度对东海原甲藻生长的影响可知，东海原甲藻进入对数生长期后，其生长会受到显著抑制，且PS-NPs的浓度越高，抑制作用越明显。
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图 2 NPs对东海原甲藻细胞密度的影响 Fig. 2 Effects of PS-NPs on density of Prorocentrum donghaiense |
为深入探究东海原甲藻在PS-NPs胁迫下抗氧化防御系统的响应，本研究对东海原甲藻细胞内的ROS含量、MDA的含量、SOD和CAT两种抗氧化酶活性进行了测定。
2.3.1 PS-NPs胁迫对东海原甲藻ROS含量的影响对比在不同浓度PS-NPs胁迫下东海原甲藻细胞内ROS含量的变化情况(见图 3(a))可知：暴露第1天，对照组和各PS-NPs组的ROS含量均处于较低水平；第3天，ROS含量显著升高，且对照组、0.1和1 mg/L PS-NPs组均在第3天达到峰值(分别为81.9%、83.7%和78.8%)，此时东海原甲藻处于迟滞期，该时期其适应新的生长环境；第6—12天，东海原甲藻进入对数生长期和稳定期，其细胞内的ROS含量有所下降，但不同浓度的PS-NPs组均显著高于对照组(p＜0.05)；第6和9天，10 mg/L PS-NPs组的ROS含量显著高于0.1和1 mg/L PS-NPs组(p＜0.05)；第15天，对照组细胞内ROS含量有所上升，这可能是由于东海原甲藻的生长进入衰亡期，细胞代谢和生理功能发生变化，导致细胞内的ROS含量增加；而0.1和1 mg/L PS-NPs组细胞内ROS含量相近，除第6和15天以外并无显著差异。结果显示，PS-NPs的加入会诱导对数增长期和稳定期的东海原甲藻细胞内生成ROS，且10 mg/L PS-NPs的诱导作用强于0.1和1 mg/L PS-NPs。
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图 3 PS-NPs对东海原甲藻抗氧化系统的影响 Fig. 3 Effects of PS-NPs on antioxidant system of Prorocentrum donghaiense |
东海原甲藻细胞内的MDA含量大致呈先上升后下降的趋势(见图 3(b))：第6—15天，0.1 mg/L PS-NPs组藻细胞的MDA含量显著高于对照组(p＜0.05)，并显著低于10 mg/L PS-NPs组(p＜0.05)；第3天，1和10 mg/L PS-NPs组的MDA含量除均显著高于对照组(p＜0.05)，且1 mg/L PS-NPs组的MDA含量显著低于10 mg/L PS-NPs组(p＜0.05)。上述结果证明，PS-NPs会增加东海原甲藻细胞内的MDA含量，造成细胞损伤，其中10 mg/L PS-NPs对东海原甲藻细胞内MDA含量的诱导作用最显著。
2.3.3 PS-NPs胁迫对东海原甲藻抗氧化酶活性的影响对照组藻细胞内的SOD活性随着培养时间的延长持续下降，但在最后一天有所回升(见图 3(c))。除第1和6天外，3个浓度的PS-NPs组的SOD活性均显著高于对照组(p＜0.05)，且在第9天达到最高值，分别为对照组的3.62、4.14和4.69倍，这表明PS-NPs能够诱导藻细胞内SOD活性的升高。在第1—6天，10 mg/L PS-NPs组的SOD活性同0.1和1 mg/L PS-NPs组并无显著差异，但从第9天开始，10 mg/L PS-NPs组的SOD活性显著高于0.1和1 mg/L PS-NPs组(p＜0.05)，这表明10 mg/L PS-NPs对东海原甲藻细胞内SOD活性的诱导作用大于0.1和1 mg/L PS-NPs。
对照组藻细胞内的CAT活性随培养时间的增加呈波浪式变化(见图 3(d))。除实验第6天外，不同浓度的PS-NPs组的CAT活性均显著高于对照组(p＜0.05)，说明在PS-NPs的胁迫下东海原甲藻细胞内的CAT活性有所升高。0.1和1 mg/L PS-NPs组间的CAT活性并无显著差异；除第1和12天，10 mg/L PS-NPs组的CAT活性均高于0.1和1 mg/L PS-NPs组，在第3和9天具有显著差异(p＜0.05)。实验结果表明，0.1和1 mg/L PS-NPs对东海原甲藻细胞内CAT活性的影响相近，且都小于10 mg/L PS-NPs。
在本研究中，从对数生长期开始，东海原甲藻的抗氧化系统便被激活，PS-NPs处理组的SOD和CAT活性升高，但是不足以消除细胞内过量的ROS，各PS-NPs处理组对数生长期和稳定期的ROS水平均高于对照组。从第6天开始，PS-NPs处理组的MDA含量显著高于对照组，表明在PS-NPs胁迫下东海原甲藻细胞内发生了脂质过氧化，但随着培养时间的延长，脂质过氧化的程度会缓慢降低。对比不同浓度的PS-NPs胁迫下东海原甲藻抗氧化系统的响应发现，其在10 mg/L PS-NPs胁迫下的氧化应激反应程度高于0.1和1 mg/L PS-NPs。
2.4 PS-NPs胁迫对东海原甲藻细胞凋亡的影响东海原甲藻的磷脂酰丝氨基残基外翻细胞(Annexin-V-FITC阳性细胞)的占比随培养时间的延长整体呈先上升后下降的趋势(见图 4)。从第3天东海原甲藻进入对数生长期后，不同浓度的PS-NPs组均显著高于对照组(p＜0.05)，说明PS-NPs的加入会增加东海原甲藻的Annexin-V-FITC阳性细胞的占比。在第6—12天，对比不同浓度PS-NPs胁迫对Annexin-V-FITC阳性细胞百分比的影响发现，PS-NPs浓度越高，Annexin-V-FITC阳性细胞占比越大，且存在显著性差异(p＜0.05)。
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图 4 PS-NPs对东海原甲藻Annexin-V-FITC阳性细胞的影响 Fig. 4 Effects of PS-NPs on Annexin-V-FITC positive cells of Prorocentrum donghaiense |
根据细胞层面的研究结果发现，0.1和1 mg/L PS-NPs处理组的东海原甲藻在藻细胞密度、ROS含量和CAT活性等生理生化指标的响应方面较一致，因此，本研究选择对对照组、0.1 mg/L和10 mg/L PS-NPs处理组进行转录组学分析。根据差异倍数以及差异显著性检验对东海原甲藻转录组的差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGs)进行筛选(见图 5)。结果显示，10 mg/L PS-NPs对东海原甲藻转录组的影响更加明显，在第7、13和17天，10 mg/L PS-NPs组与对照组之间的DEGs数均高于0.1 mg/L PS-NPs组和对照组。对比不同生长时期PS-NPs组和对照组之间的DEGs数发现，0.1和10 mg/L PS-NPs组与对照组相比均在稳定期有更多的DEGs数，0.1和10 mg/L PS-NPs组中分别测定出1 001个DEGs(包括602个上调和399个下调)和3 898个DEGs(包括3 605个上调和293个下调)，其次是对数生长期，衰亡期的DEGs数量最少。
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( 在横坐标各实验组名中：EP、SP和DP分别表示指数期、稳定期和衰亡期；0、0.1和10分别表示PS-NPs浓度(单位：mg/L)。In the names of each experimental group on the horizontal axis EP, SP and DP represent exponential phase, stationary phase and decline phase; 0, 0.1, and 10 represent the different concentrations of PS-NPs (Unit: mg/L). ) 图 5 差异表达基因统计图 Fig. 5 Statistical histogram of differentially expressed genes |
为更深入地解释转录组的表达情况，本研究对各处理组进行主成分分析(见图 6)。结果显示，EP0和EP0.1之间、SP0和SP0.1之间、DP0和DP0.1之间、DP0和DP10之间的样本相似度较高，而EP0与EP10之间、SP0与SP10之间的样本相似度较低，因此选取EP0和EP10之间、SP0和SP10之间进行GO和KEGG富集分析(见图 7和8)。GO富集分析结果表明，EP0 vs EP10和SP0 vs SP10中的DEGs在生物过程、细胞组分和分子功能分类单元中均有显著富集，且主要集中在生物过程。EP0 vs EP10在生物过程中富集程度较高的为酰胺生物合成过程(Amide biosynthetic process)和细胞酰胺代谢过程(Cellular amide metabolic process)，在细胞组分中富集程度较高的为蛋白质复合物(Protein-containing complex)和核糖体(Ribosome)相关成分；SP0 vs SP10在生物过程中富集程度较高的为细胞器组装(Organelle assembly)和纤毛组织化(Cilium organization)，在细胞组分中富集程度较高的为纤毛(Cilium)和核糖体(Ribosome)相关成分；EP0 vs EP10和SP0 vs SP10在分子功能中富集程度较高的为核糖体的结构组成(Structural constituent of ribosome)和结构分子活性(Structural molecule activity)。通过KEGG富集通路分析发现，EP0 vs EP10和SP0 vs SP10的DEGs主要富集在核糖体(Ribosome)、蛋白酶体(Proteasome)和氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等过程。此外，在SP0 vs SP10中发现，内质网蛋白质加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)过程中的DEGs上调，在EP0 vs EP10和SP0 vs SP10下调的DEGs中发现，这两组的DEGs分别在光合作用-天线蛋白(Photosynthesis-antenna proteins)和光合作用(Photosynthesis)通路中富集程度显著。
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( 在图例各实验组名中：EP、SP和DP分别表示指数期、稳定期和衰亡期；0、0.1和10分别表示PS-NPs浓度(单位：mg/L)。In the names of each experimental group on the legend: EP, SP and DP represent exponential phase, stationary phase and decline phase; 0, 0.1, and 10 represent the different concentrations of PS-NPs (Unit: mg/L). ) 图 6 差异表达基因主成分分析 Fig. 6 Principal component analysis of differentially expressed genes |
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( ①Protein-containing complex, GO: 0032991; ②Ribosome, GO: 0005840; ③Proteasome complex, GO: 0000502; ④Endopeptidase complex, GO: 1905369; ⑤Motile cilium, GO: 0031514; ⑥Peptidase complex, GO: 1905368; ⑦Cytosol, GO: 0005829; ⑧Ribonucleoprotein complex, GO: 1990904; ⑨Cytosolic ribosome, GO: 0022626; ⑩Cilium, GO: 0005929; B11 Structural constituent of ribosome, GO: 0003735; B12 Structural molecule activity, GO: 0005198; B13 Carbohydrate derivative binding, GO: 0097367; B14 Ribonucleotide binding, GO: 0032553; B15 Purine ribonucleotide binding, GO: 0032555; B16 Purine nucleotide binding, GO: 0017076; B17 Purine ribonucleoside triphosphate binding, GO: 0035639; B18 CoA carboxylase activity, GO: 0016421; B19 Ligase activity, forming carbon-carbon bonds, GO: 0016885; B20 Nucleoside-triphosphatase activity, GO: 0017111; B21 Amide biosynthetic process, GO: 0043604; B22 Cellular amide metabolic process, GO: 0043603; B23 Translation GO: 0006412; B24 Peptide biosynthetic process, GO: 0043043; B25 Peptide metabolic process, GO: 0006518; B26 Organonitrogen compound biosynthetic process, GO: 1901566; B27 Cellular nitrogen compound biosynthetic process, GO: 0044271; B28 Cell projection organization, GO: 0030030; B29 Cellular protein-containing complex assembly, GO: 0034622; B30 Microtubule-based movement, GO: 0007018; B31 Ribosomal subunit, GO: 0044391; B32 Cytosolic large ribosomal subunit, GO: 0022625; B33 Large ribosomal subunit, GO: 0015934; B34 Axoneme, GO: 0005930; B35 Ciliary plasm, GO: 0097014; B36 Threonine-type endopeptidase activity, GO: 0004298; B37 Threonine-type peptidase activity, GO: 0070003; B38 Motor activity, GO: 0003774; B39 Pyrophosphatase activity, GO: 0016462; B40 Hydrolase activity, acting on acid anhydrides, in phosphorus-containing anhydrides, GO: 0016818; B41 Hydrolase activity, acting on acid anhydrides, GO: 0016817; B42 Dynein intermediate chain binding, GO: 0045505; B43 Organelle assembly, GO: 0070925; B44 Cilium organization, GO: 0044782; B45 Cilium assembly, GO: 0060271; B46 Cell projection assembly, GO: 0030031; B47 Cell projection organization, GO: 0030030. ) 图 7 EP0 vs EP10(a)和SP0 vs SP10(b)的差异表达基因的GO富集情况 Fig. 7 GO enrichment of differentially expressed genes of EP0 vs EP10 (a) and SP0 vs SP10 (b) |
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( ①Ribosome; ②Proteasome; ③Oxidativephosphorylation; ④Aflatoxin biosynthesis; ⑤Phagosome; ⑥Propanoate metabolism; ⑦Selenocompound metabolism; ⑧Aminoacyl-tRNA biosynthesis; ⑨Valine, leucine and isoleucine degradation; ⑩Cysteine and methionine metabolism; B11 One carbon pool by folate; B12 Alanine, aspartate and glutamate metabolism; B13 Protein export; B14 Ribosome biogenesis in eukaryotes; B15 Photosynthesis-antenna proteins; B16 Endocytosis; B17 Pyruvate metabolism; B18 Fatty acid biosynthesis; B19 RNA polymerase; B20 Fatty acid elongation; B21 Protein processing in endoplasmic reticulum; B22 SNARE interactions in vesicular transport; B23 Biosynthesis ofunsaturated fatty acids; B24 Sphingolipid metabolism; B25 Autophagy-other; B26 Ubiquitin mediated proteolysis; B27 MAPK signaling pathway.plant; B28 Tryptophan metabolism; B29 Polyketide sugar unit biosynthesis. ) 图 8 EP0 vs EP10(a)和SP0 vs SP10(b)的差异表达基因的KEGG富集情况 Fig. 8 KEGG enrichment of differentially expressed genes of EP0 vs EP10 (a) and SP0 vs SP10 (b) |
根据以上分析结果，研究重点选取氧化磷酸化、过氧化物酶体(Peroxisome)和光合作用三大类代谢途径中相关基因表达量的变化情况，旨在从分子层面探究PS-NPs对东海原甲藻的影响(见图 9)。研究结果显示：第7和13天，0.1和10 mg/L PS-NPs组的细胞色素c氧化酶亚基6B(Cytochrome c oxidase subunit 6B，COX6B)基因表达量与对照组相比，均随PS-NPs浓度的增加而发生上调；第17天，0.1和10 mg/L PS-NPs组同对照组相比差异不大，表明PS-NPs的加入促进了东海原甲藻的电子跨膜转运过程，提高了微藻对氧气的利用率，调整了呼吸效率，进而促进了能量的传递，以应对胁迫环境。在整个实验周期内，0.1 mg/L PS-NPs组的铜/锌超氧化物歧化酶(Copper/Zinc suoeroxide dismutase，Cu/Zn SOD)的基因表达量同对照组相比略有升高，10 mg/L PS-NPs组同0.1 mg/L PS-NPs组和对照组相比，其表达量显著升高；第7和13天，两个PS-NPs组的CAT基因表达量随PS-NPs浓度的上升而发生上调，证明PS-NPs的加入会使东海原甲藻产生氧化应激反应，促进了Cu/Zn SOD和CAT的表达。在PS-NPs的胁迫下，东海原甲藻与光合作用相关的差异表达基因主要来自光系统Ⅰ。相比对照组，第13和17天，0.1和10 mg/L PS-NPs组中光捕获复合体(Light-harvesting complex stress-related，LHCSR)基因表达量小于对照组，这说明在PS-NPs的影响下东海原甲藻对光的捕获能力下降了。
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( 在横坐标各实验组名中EP、SP和DP分别表示指数期、稳定期和衰退期；0、0.1和10分别表示PS-NPs浓度(单位：mg/L)。In the names of each experimental group on the horizontal axis. EP, SP and DP represent exponential phase, stationary phase and decline phase; 0, 0.1, and 10 represent the different concentrations of PS-NPs (Unit: mg/L). ) 图 9 东海原甲藻代谢通路热图 Fig. 9 Heatmap of metabolic pathways of Prorocentrum donghaiense |
有研究发现，PS-NPs对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)生长的抑制效应与PS-NPs的浓度正相关[17]；刘旻昊等[18]通过研究20、200和2 000 μg/L PS-NPs对隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)细胞密度的影响发现，NPs暴露浓度越高，该藻受到的生长抑制作用越显著。这些研究结果与本研究各浓度的PS-NPs均会对东海原甲藻的生长产生一定抑制作用的结果相类似，其原因可能是PS-NPs粒径(0.1 μm)小，吸附性强，可能会进入到藻细胞内[19]，影响藻细胞的物质和能量代谢[20]，并且PS-NPs可能会对东海原甲藻的细胞膜等结构造成损伤[21]，从而抑制藻细胞的生长。
Mahana等[22]发现，微藻在有毒物质的胁迫下会产生过量的ROS，从而产生氧化应激反应，这是微塑料对微藻的主要致毒机制之一[23]。张秀丽等[24]的结果表明，10 mg/L PS-NPs的加入会导致中肋骨条藻(Skeletonema costatum)细胞内ROS水平的升高，如果活性氧未能及时被清除，会导致细胞内MDA含量升高，从而对细胞膜造成损伤。为维持细胞稳态，微藻会生成SOD和CAT抗氧化酶，清除细胞内的超氧根离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)，减轻细胞损伤程度[25]。本研究中，东海原甲藻在PS-NPs胁迫下，SOD和CAT的活性升高，表现出自我调节能力，但是细胞内的ROS水平和MDA含量仍较高，表明其细胞内发生了脂质过氧化，可能会导致膜损伤。
导致微藻细胞死亡的形式有两种，分别是细胞凋亡[26]和细胞坏死[27]。当细胞发生凋亡时，磷脂酰丝氨基酸会从细胞膜内侧转移到细胞表面，与Annexin-V-FITC染料结合，因此Annexin-V-FITC阳性细胞的比例可以代表细胞凋亡率。Zhang等[28]的研究证明，假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)在PS-MPs胁迫下的细胞凋亡率增加与ROS水平的升高有关。此前，Lagarde等[29]也观察到莱茵衣藻中细胞凋亡相关基因表达水平在聚乙烯微塑料的影响下会发生上调，这也提示了细胞死亡的可能性。在本研究中，不同浓度的PS-NPs组中东海原甲藻的细胞凋亡率在对数生长期和稳定期均增加，同时藻细胞内的ROS水平也有一定程度的升高。这证明了东海原甲藻细胞凋亡率的增加可能是由于藻细胞产生氧化应激反应造成的。
3.2 PS-NPs胁迫对东海原甲藻分子层面的影响氧化磷酸化过程通常发生于细胞线粒体内膜上，属于能量代谢途径，线粒体内膜电子传递链分别由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素c还原酶和细胞色素c氧化酶这4种蛋白质复合物组成[30]。过氧化物酶体是真核生物中的一种单层膜细胞器，主要负责细胞内ROS产生和清除[31]，Cu/Zn SOD和CAT是2种关键的抗氧化酶。本研究中，东海原甲藻氧化磷酸化过程中COX6B的表达量上调表明细胞可能处于氧化胁迫状态。为应对氧化应激，过氧化物酶体通路中的Cu/Zn SOD和CAT的表达量上调，从而增强了SOD和CAT活性，这与本研究中细胞层面抗氧化系统的响应相一致。类囊体膜上的光系统Ⅰ(Photosystem Ⅰ，PSⅠ)和光系统Ⅱ(Photosystem Ⅱ，PSⅡ)是光吸收的功能单位[32]。Zheng等[9]通过将铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)暴露于聚酰胺微塑料环境中发现，微囊藻PSⅠ和PSⅡ分别有10和9个相关基因的表达量下调，电子传递效率降低，进而影响藻细胞的光捕获能力和光合作用。Gao等[33]通过对小球藻(Chlorella vulgarism)的聚乙烯微塑料组与空白对照组的差异表达基因进行KEGG富集分析发现，核糖体、蛋白酶体和内质网这3个细胞器的蛋白加工过程变化显著，这与本研究的结果类似。蛋白酶体在细胞中扮演着关键角色，可调控特定蛋白质和去除错误折叠蛋白质，涉及到细胞周期调控、细胞凋亡、氧化应激以及基因转录等多个过程[34]。在微/纳米塑料的胁迫下，微藻会产生氧化应激反应，导致蛋白酶体相关基因表达变化，同时也会造成内质网稳态失衡，影响内质网的正常生理功能[35]。
4 结论(1) PS-NPs对东海原甲藻的生长抑制作用与PS-NPs的浓度有关。在10 mg/L PS-NPs暴露条件下，东海原甲藻受到的抑制作用大于0.1和1 mg/L PS-NPs处理组。
(2) 在PS-NPs的胁迫下，东海原甲藻的抗氧化系统被激活并产生相应响应。细胞内的ROS水平上升，MDA含量增加，这反映出细胞遭受了氧化损伤。为应对这种环境胁迫，细胞内SOD和CAT两种抗氧化酶的活性升高，以清除体内过多的ROS，维持细胞内氧化还原平衡。其中，10 mg/L PS-NPs处理组的氧化应激水平高于0.1和1 mg/L的PS-NPs。
(3) PS-NPs暴露会增加东海原甲藻的细胞凋亡率，且细胞凋亡率与PS-NPs浓度正相关。
(4) 在细胞生长指数期和稳定期，10 mg/L PS-NPs对东海原甲藻转录组水平的影响更大。通过KEGG和GO富集分析发现，东海原甲藻在经过NPs暴露后，其核糖体、蛋白酶体和内质网蛋白质加工相关的基因表达会发生变化，以应对胁迫环境。在PS-NPs胁迫下，东海原甲藻过氧化物酶体通路中的Cu/Zn SOD和CAT以及氧化磷酸化通路中的COX6B等基因表达量上调，这一结果从分子水平上为藻细胞产生氧化应激反应提供了证据。此外，光合作用天线蛋白通路中的LhcSR基因表达量下调，这表明PS-NPs抑制了东海原甲藻的光能捕获效率。
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