2025, Vol. 55
2. 威海汇海海洋科技有限公司，山东 威海 264400;
3. 自然资源部第四海洋研究所，广西 北海 536015;
4. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100;
5. 中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003
近年来，由甲藻引发的有害藻华(Harmful algal blooms, HABs)在中国沿海水域发生的频率、范围、时间和危害均呈上升趋势[1-2]。太平洋亚历山大藻(Alexandrium pacificum)作为一种在海洋中分布广泛的有毒甲藻，因其适应能力强、生存范围广，已成为全球最重要的有毒赤潮原因种之一[3]，在中国近海也频繁引发赤潮，且常伴随大量麻痹性贝类毒素产生，这样不仅破坏海洋生态环境，而且对海洋渔业造成巨大经济损失[4-5]。此外，其释放的毒素进入水体后被鱼类、虾类和贝类等捕食，并通过食物网不断积累放大，最终对人体健康构成严重威胁[6]。
磷(Phosphorus, P)是浮游植物生长所必需的营养物质，是组成细胞结构(DNA、RNA和磷脂等)和参与新陈代谢(核苷酸、NADH)的主要元素[7-9]。与某些生物可通过固氮(N2)的方式补充氮源不同，海洋自然源溶解磷几乎只来自缓慢的岩石风化[10]，因此磷的短缺常常成为自然水域浮游植物初级生产力的限制因素[11-12]。
海水中存在多种形式的生物可利用磷，包括无机磷和有机磷[13]。其中，溶解态无机磷(Dissolved inorganic phosphorus，DIP)主要以正磷酸盐(HPO42-和PO43-)形式存在，是浮游植物首选的磷源，可被直接吸收和同化[14]。然而，海水中DIP的浓度通常低于0.5 μmol·L-1，这成为浮游植物生长的主要限制因素[8, 15]。为应对磷的缺乏，浮游植物进化出多种适应策略。例如已有研究[9, 16]表明，某些甲藻能够通过合成碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)水解磷单酯，从而在缺乏DIP的情况下维持生长。这种利用DOP的能力使这些甲藻具有潜在的竞争优势，尤其是在富含DOP的沿岸水域[17-18]。有研究报道，典型产毒甲藻太平洋亚历山大藻可利用三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)、D-葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate, G-6-P)和β-甘油磷酸(β-Glycerol phosphoric acid, SG-P)等有机磷维持生长，并在液泡中以多聚磷酸盐的形式储存大量磷，以便在环境中磷缺乏时使用[19-20]。然而，关于太平洋亚历山大藻对不同磷源的利用能力及其生理响应的研究仍较为有限。
本研究通过分析太平洋亚历山大藻对不同磷源的利用效率和生理响应，研究其对不同磷源的适应性，旨在为进一步阐明太平洋亚历山大藻在缺磷条件下竞争优势的形成机制及有害藻华的爆发机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 藻种来源太平洋亚历山大藻种分离自中国长江口附近海域。该藻株在f/2-Si培养基中培养[21]，培养条件如下: 海水盐度30±0.1，温度(20±1) ℃，光暗比12 h∶12 h，光照强度75 μmol·m-2·s-1。为抑制培养物中真菌和细菌的生长，接种前在培养基中加入抗生素-抗真菌素(青霉素10 kU/mL，链霉素10 mg/mL，两性霉素B 25 μg/mL)溶液(供应商: Solarbio公司，北京)进行无菌处理。
1.2 磷源利用能力的测定将实验藻种饥饿培养48 h以消耗胞内磷酸盐。PM4A磷源板(包含54种有机磷和5种无机磷)购自美国Biolog公司[22]。在无菌条件下，向PM4A板孔中加入100 μL灭菌海水使磷源充分溶解，并在各孔中取50 μL磷源转移到对应的细胞培养板中，并分别加入150 μL饥饿培养后的太平洋亚历山大藻，使各微孔总体积为200 μL，各微孔板中磷源浓度均约为36 μmol/L。该实验设置三个平行，并把细胞培养板放置在同一个光照培养箱下共培养24 d，培养条件同本文2.1节。每隔2 d在同一时间用全自动EnSight多功能酶标仪(供应商: Perkinelmer公司)测定其在680 nm[23-24]下各微孔的吸光度，根据计算所得藻细胞密度和比生长速率判断其对不同磷源的利用能力。接种的初始藻密度为1×104 cells·mL-1。
通过培养实验测定藻细胞密度及其在OD680nm下的吸光度值AOD680nm，得到如下藻细胞数N(单位: cells·mL-1)的计算方程:
| $ N=282~683 A_{\mathrm{OD} 680 \mathrm{~nm}}+193.21, R^2=0.995。$ | (1) |
比生长速率μ计算式为
| $ \mu=\frac{\ln N_1-\ln N_0}{t_1-t_0} 。$ | (2) |
式中: t1和t0分别为对数增长期的取样起、止时间，N1和N0分别为t1和t0时的藻密度。
1.3 生长生理指标的测定 1.3.1 实验分组实验开始前取处于对数生长期、生长状态良好的藻种进行无磷饥饿培养48 h，以耗尽其胞内磷酸盐。初始时刻记作第0天，初始接种密度为(200±10) cells·mL-1。实验设置无机磷(NaH2PO4)和有机磷(SG-P)两种磷源，两种磷源的初始磷浓度均设置为0(无磷组)、9(低磷组)、18(中磷组)、36(高磷组) μmol·L-1，其余营养成分按照f/2-Si配方配制。各组设置3个平行实验组，共培养24 d，培养条件同本文2.1节。培养实验期间每隔2 d在同一时间采一次样，进行各项指标测定。
1.3.2 细胞生长速率测定从不同培养体系中各取1 mL藻液，将藻液用鲁格试剂固定并涡旋摇匀后，取100 μL于浮游生物计数框内，用AE2000-T倒置显微镜(供应商: Motic公司)计数，然后计算藻细胞密度，每个样品计数3次，比生长速率用式(2)计算。
比生长速率与磷浓度之间的关系拟合使用Monod生长动力学模型[25]:
| $ \mu=\frac{\mu_{\mathrm{m}} \times S}{K_{\mathsf{μ}}+S}。$ | (3) |
式中: μm为最大比生长速率(d-1); S为底物磷浓度(μmol·L-1); Kμ为半饱和常数(μmol·L-1)。
1.3.3 碱性磷酸酶活性的测定胞内和胞外碱性磷酸酶活性的测定均采用荧光法，依据3-0-甲基荧光素磷酸中3-0-甲基荧光素的释放量测定[26]。从各培养体系中取藻液50 mL，低温离心(4 ℃，2 000g，10 min)收集藻细胞和上清液。取2 mL胞外酶上清液，使用P0321S碱性磷酸酶试剂盒(供应商: 上海碧云天生物技术股份有限公司)，在酶标仪下测定其在405 nm处吸光度并计算酶活性，单位为μmol·h-1·cell-1。然后将细胞破碎处理后用同法测定胞内酶活性。细胞破碎方法如下: 用低温冷冻研磨仪(型号: JXFSTPRP-Ⅱ; 品牌: 上海净信)在4 ℃，6 m·s-1，30 s条件下破碎藻细胞，镜检确认无完整藻细胞。
1.3.4 藻毒素种类及含量的测定根据生长周期变化，选取对数生长期的太平洋亚历山大藻(第10天)进行藻细胞毒素测定。取各组藻液30 mL。进行低温离心(4 ℃，2 000g，10 min)，然后将藻细胞保存在-80 ℃下备用。测定前加入0.05 mol·L-1乙酸，用冷冻研磨仪(4 ℃，6 m·s-1，30 s)破碎藻细胞，在4 ℃下以10 000g离心10 min，取上清液，采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)分析麻痹性贝毒(Paralytic shellfish toxins, PST)的含量和组成[27-28]。
1.4 数据处理各组数据均以平均值(Mean)±标准偏差(SD)来表示，并使用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，P < 0.05表示存在显著差异。用Origin2023软件拟合Monod曲线。
2 结果与分析 2.1 太平洋亚历山大藻对不同磷源的利用能力在59种磷源条件下，太平洋亚历山大藻在不同时期的最大藻密度如图 1所示，初始藻密度均约为1×104 cells·mL-1，选取其生长周期内的前、中、后三个代表性阶段进行比较，该藻种在对数增长期的比生长速率如图 2所示。结果表明: 太平洋亚历山大藻对不同磷源的利用具有选择性，且具有不同的利用能力。在59种磷源中，有5种DIP和43种DOP可被太平洋亚历山大藻较好地利用，有11种磷源则几乎不能被利用。在可利用的磷源中，藻细胞对β-甘油磷酸的利用效果最好，然后依次为6-磷酸葡萄糖酸、磷酸盐和硫代磷酸盐(酯)，它们的最大藻密度分别为(2.52±0.05)×104、(2.51±0.07)×104、(2.46±0.02)×104和(2.39±0.02)×104 cells·mL-1，其比生长速率分别为(0.35±0.02)、(0.32±0.01)、(0.31±0.01)和(0.31±0.01) d-1。不能被利用的磷源有磷酸乙醇酸、亚甲基二磷酸和磷酸精氨酸等11种，最大藻密度均低于接种时的初始密度，且其比生长速率均为负增长。在可利用的有机磷源中，硫代硫酸盐(酯)组和2′-单磷酸鸟苷组的比生长速率均同无机磷酸盐组无显著差异，利用效率基本相同，而对β-甘油磷酸和6-磷酸葡萄糖酸的利用效果要好于无机态磷酸盐，这表明太平洋亚历山大藻对这几种有机磷有很强的利用能力，在海洋无机磷缺乏的环境中该藻能有效利用部分有机磷进行快速增长繁殖。
|
图 1 59种磷源下太平洋亚历山大藻在不同时期的藻密度 Fig. 1 Algae density of Alexandrium pacificum at different time under 59 phosphorus sources |
|
图 2 不同磷源下太平洋亚历山大藻比生长速率 Fig. 2 Specific growth rate of Alexandrium pacificum under different phosphorus sources |
如表 1和图 3、4、5所示，将54种有机磷源按照磷键、酯类和营养类型进行划分，太平洋亚历山大藻对不同的磷源选择具有差异性和偏好性。按照磷键的组成，可以将有机磷划分为含C—O—P、C—P和其他键的有机磷，在46种含C—O—P键的有机磷中，41种可被充分利用，效果最好的为β-磷酸甘油，其次为6-磷酸葡萄糖; 3种含C—P键的有机磷(磷酰基乙酸、2-氨基乙基膦酸、亚甲基二磷酸)均不能被太平洋亚历山大藻利用; 5种其他类磷源中只有含S—P键的硫代硫酸盐(酯)和含S=P键的二硫代磷酸盐可被利用。按照酯类不同，可以将有机磷划分为单酯、双酯和非酯类，在42种单酯磷源中，有38种可被太平洋亚历山大藻利用，其中利用效率最高的为β-磷酸甘油，次高的为6-磷酸葡萄糖; 在3种双酯磷源中，只有二硫代磷酸盐可被利用，磷酰胆碱和O-磷酰乙醇胺则不能被利用; 非酯类的9种有机磷中有4种可以被利用，包括六磷酸肌醇(植酸)、氨基甲酰磷酸、硫代磷酸盐(酯)和磷酸烯醇式丙酮酸，其中利用效率最高的为硫代磷酸盐(酯)。将有机磷源按营养类型划分为核苷酸类、磷酸类、甘油类、葡萄糖类、氨基酸类和其他类，23种核苷酸类中利用效率最高的是2’, 3’-环单磷酸胞苷，次高的是2’-单磷酸鸟苷; 4种甘油类和7种葡萄糖类均可以被太平洋亚历山大藻利用，甘油类中利用效率最高的是β-甘油磷酸，葡萄糖类中利用效率最高的是6-磷酸葡萄糖酸; 9种磷酸类中只有5种可以被利用，其中利用效率最高的是硫代磷酸盐(酯); 8种氨基酸类中只有4种可以被利用，利用效率最高的是氨基甲酰磷酸。
|
表 1 太平洋亚历山大藻可利用有机磷源分类 Table 1 Types and proportion of available phosphorus sources of Alexandrium pacificum |
|
图 3 不同磷键的磷源对太平洋亚历山大藻增殖效应 Fig. 3 Proliferation effect of different phosphorus bond phosphorus sources on Alexandrium pacificum |
|
图 4 不同酯类的磷源对太平洋亚历山大藻增殖效应 Fig. 4 Proliferative effects of phosphorus sources of different esters on Alexandrium pacificum |
|
图 5 不同营养类型的磷源对太平洋亚历山大藻增殖效应 Fig. 5 Proliferative effects of phosphorus sources of different nutrient types on Alexandrium pacificum |
本研究中太平洋亚历山大藻的生长周期可分为迟缓期(0~4 d)、对数增长期(4~12 d)、平台期(12~20 d)和衰亡期(20~24 d)。以无机磷(NaH2PO4)为磷源，不同浓度下太平洋亚历山大藻的生长曲线如图 6(a)所示: 藻密度随磷浓度的升高而增加，各浓度组间具有显著性差异。低、中、高磷组藻密度和生长速度在对数增长期(0~12 d)基本保持一致，但达到峰值的时间不同，分别在第12、14和16天进入平台期，藻密度最高值分别为(1.57±0.02)×104、(1.89±0.11)×104和(2.24±0.03)×104cells·mL-1，比生长速率最高值分别为(0.26±0.01)、(0.28±0.01)和(0.30±0.01)d-1，可见磷浓度越高，最大藻密度和生长速率均越高。低磷组经过短暂平台期后藻密度开始明显下降，中磷和高磷组则分别在第20和22天进入衰亡期，且至第24天，藻密度仍都保持在较高水平。可见，高磷浓度对藻细胞的生长和繁殖能力维持时间更持久。
|
(①培养基中以NaH2PO4为磷源的P浓度P。Concentration in the medium with NaH2PO4 as phosphorus source; ②培养基中以SG-P为磷源的P浓度。P Concentration in the medium with SG-P as phosphorus source.) 图 6 太平洋亚历山大藻在NaH2PO4和SG-P不同浓度下生长曲线(a)、(b)及Monod拟合曲线(c)、(d) Fig. 6 Growth curves (a)、(b) and Monod fitting curves (c)、(d) of Alexandrium pacificum under different concentrations of NaH2PO4 and SG-P |
以有机磷(SG-P)为唯一磷源，不同浓度下太平洋亚历山大藻生长曲线如图 6(c)所示。总体变化趋势与无机磷相似，0~4 d，低、中、高磷下各组的藻密度和生长率变化差异不显著; 4 d后进入对数生长期，也分别于第12、14和16天进入平台期，最大比生长速率分别为(0.27±0.01)、(0.28±0.01) 和(0.30±0.01) d-1，最大藻密度分别为(1.68±0.04)×104、(1.86±0.03)×104和(2.21±0.04)×104 cells·mL-1，与无机磷的各组之间无显著差异，均随磷浓度的升高而增加，对数生长期和平台期维持的时间也更长，但高浓度有机磷组在第24天的藻密度仍无明显减少，平台期较高无机磷组维持时间更长。
不同磷源条件下太平洋亚历山大藻的生长动力学均符合标准的Monod模型，如图 6(b)和(d)所示。无机和有机磷源下，最大比生长速率(μm)分别为(0.31±0.02)和(0.32±0.01) d-1，半饱和常数(Kμ)分别为(1.72±0.19) μmol·L-1和(1.34±0.11) μmol·L-1。SG-P和NaH2PO4组的生长速率无明显差别，但对Kμ而言，NaH2PO4组的速率约为SG-P的1.28倍; 两种磷源在相同浓度下的比生长速率几乎一致，且都随着磷浓度的增大而增加(见表 2)。
|
|
表 2 不同磷源下太平洋亚历山大藻的比生长速率 Table 2 Specific growth rate of Alexandrium pacificum under different phosphorus sources |
在不同浓度NaH2PO4和SG-P下，本研究测定了太平洋亚历山大藻在不同培养时间藻细胞内(图 7(a)和图 7(b)和细胞外(图 8(a)和图 8(b)碱性磷酸酶活性。
|
图 7 不同浓度NaH2PO4(a)及SG-P(b)为磷源时胞内碱性磷酸酶活性 Fig. 7 Cellular alkaline phosphatase activity at different concentrations of NaH2PO4 (a) and SG-P (b) as phosphorus sources |
|
图 8 不同浓度NaH2PO4(a)及SG-P(b)为磷源时胞外碱性磷酸酶活性 Fig. 8 Extracellular cellular alkaline phosphatase activity at different concentrations of NaH2PO4 (a) and SG-P (b) as phosphorus sources |
在无磷条件下，0~12 d，胞内和胞外的碱性磷酸酶活性均随培养时间延长而显著升高。胞内酶活性在第12天达最大值(2.55±0.14) μmol·L-1·h-1·cell-1，在平台期和衰亡期(16~24 d)趋于平稳，维持在(1.96±0.08)~(2.05±0.05) μmol·L-1·h-1·cell-1; 胞外酶变化趋势与胞内酶一致，但酶活性远低于胞内酶，最高仅为(22.33±0.83)×10-3 μmol·L-1·h-1·cell-1; 无磷培养下胞内外碱性磷酸酶一直保持较高的活性，与添加磷源的实验组具有显著性差异。
在NaH2PO4及SG-P培养条件下，低、中、高磷源浓度组胞内碱性磷酸酶活性都呈现出先降低后升高的趋势，胞外酶活性在整个生长周期内均趋于稳定，两种磷源之间在各相同浓度下的酶活性均无显著差异。各组胞内酶活性均在培养初期最高((1.39±0.07)~ (1.41±0.08) μmol·L-1·h-1·cell-1)，各组间无显著差异。各浓度组胞内酶活性均在对数增长期开始逐步降低，低、中、高浓度组胞内酶活最低值分别如下: 无机磷组: (0.29±0.01)、(0.28±0.01)和(0.19±0.02) μmol·L-1·h-1·cell-1; 有机磷组: (0.31±0.00)、(0.32±0.01)和(0.20±0.00) μmol·L-1·h-1·cell-1。磷浓度越高，胞内酶活性越低。在平台期和衰亡期，随着磷源的消耗，胞内碱性磷酸酶活性又呈上升趋势，但回升时间和幅度不同，低、中、高磷组酶活性分别从第8、16和20天开始上升，磷浓度越高，回升开始时间越晚，上升幅度也越小。各组胞外酶活性在整个藻细胞生长周期内均趋于稳定，约为5×10-3 μmol·L-1·h-1·cell-1，显著低于胞内酶活性。
2.4 太平洋亚历山大藻产毒能力对不同磷源及磷浓度的响应通过HPLC-MS/MS，我们分析了不同浓度NaH2PO4和SG-P作为磷源条件下，藻细胞毒素含量、种类和组成，结果如图 9(a)和图 9(b)所示: 不同磷源下单细胞毒素含量对磷源浓度的响应有所不同，以SG-P为磷源时，单细胞毒素含量随磷浓度的升高变化不大，最高值为(3.00±0.15) ×10-15 mol·cell-1; 在以NaH2PO4为磷源时，单细胞毒素含量随磷浓度的升高略有增加，最高值为(5.42±0.16)×10-15 mol·cell-1，是有机磷组的2.09倍; 而在无磷培养条件下毒素含量显著增加，达到(25.96±1.04)×10-15 mol·cell-1，分别是无机、有机磷源下的5.31和9.27倍。这表明无机磷源下藻细胞产毒能力高于有机磷源，且在磷缺乏时产毒能力更强。
|
图 9 不同浓度NaH2PO4(a)及SG-P(b)为磷源时单细胞毒素含量及毒素组成 Fig. 9 Single cell toxin content and toxin composition at different concentrations of NaH2PO4 (a) and SG-P (b) as phosphorus sources |
太平洋亚历山大藻的毒素种类和占比在不同磷源和不同浓度下存在显著差异，在共检测出的11种毒素中，各组中均可检测到的是C2、C1、GTX5、GTX1和GTX4;在缺磷条件下检出9种毒素，未被检测到neoSXT和SXT; 以NaH2PO4为磷源时，11种藻毒素均被检测出，其中在低、中磷源浓度下未检测到dcGTX2/3和GTX2/3，而在高磷浓度下未检测到新石房蛤毒素(Neosaxitoxin, NEO); 以SG-P为磷源时，除STX和NEO毒素未被检测到外，其他9类毒素均在各磷浓度组中被检出。在两种磷源培养下，毒素占比均以低毒性的C1和C2为主，在高浓度无机和有机磷下，C类毒素占比分别最高达到70.16%和71.22%，其中C2占比最高，分别占毒素总量的45.63%和45.53%;在各中、低磷浓度组中仍都以C类毒素占优势地位，各组间的占比相差不大，均在60%~70%。此外，两种磷源不同浓度下，GTX1/4在各组中占比仅次于C类毒素，占比18.06%~22.62%，是太平洋亚历山大藻第二高产毒素。
图 10(a)—(h)为两种磷源下11种主要藻毒素含量随磷浓度的变化: 在无机磷源下，各浓度组毒素均以C2、C1、GTX5和GTX1/4为主，其含量范围为(0.93±0.05)×10-15~(2.47±0.02)×10-15 mol·cell-1; 在有机磷下，毒素以C2、C1和GTX1/4和GTX5为主，其含量范围为(0.51±0.03)×10-15~(1.18±0.06)×10-15 mol·cell-1，无机磷源组是有机磷源组藻毒素含量的1.82~2.09倍; 在磷缺乏条件下以C2、C1、GTX5、dcGTX2/3、GTX2/3和GTX1/4等毒素为主，其含量分别为(9.98±0.49)×10-15、(7.99±0.32)×10-15、(1.62±0.01)×10-15、(0.65±0.01)×10-15、(0.78±0.03)×10-15、(4.93±0.20)×10-15 mol·cell-1，是不同浓度无机磷组的3.95~10.83倍，是不同浓度有机磷组的6.79~21.67倍。
|
图 10 以不同浓度NaH2PO4及SG-P为磷源时毒素分类及含量 Fig. 10 Classification and content of toxins with different concentrations of NaH2PO4 and SG-P as phosphorus sources |
此外，在不同SG-P浓度条件下均检测到了毒素GTX2/3与dcGTX2/3，而NaH2PO4为磷源时只有在高磷组中才被检出; 高毒性的neoSXT和SXT只在无机磷条件下被检测出。可见，藻细胞在有机磷条件下产生的毒素种类多于有机磷，而无机磷条件下更有利于产生高毒性的毒素。
3 讨论近年来，亚历山大藻种属引发的有害藻华常出现在长江口附近海域，这类海域通常具有较高的氮磷比(N∶P)并缺乏DIP[29-30]。已有研究表明，在缺乏DIP的情况下，亚历山大藻种属可利用DOP生存，这可能是藻华形成和持续的关键[26, 31]。本研究结果表明，太平洋亚历山大藻对磷源的利用具有选择性，可利用48种磷作为其生长所需的磷源，其中对β-甘油磷酸和6-磷酸葡萄糖的利用效果要好于无机磷酸盐。Yang等[32]对部分区域海水中不同分子量的含磷化合物进行分析发现，有机磷中的磷酸酯类占比范围为80%~85%，占据绝对优势，而磷酸盐和聚磷酸盐占比范围分别为5%~10%和8%~13%。为进一步探究太平洋亚历山大藻对不同磷源的选择性利用特点，本研究对54种有机态磷源按磷键、酯类和营养类型进行划分。结果表明: 5种无机磷源均可被太平洋亚历山大藻充分利用，无选择性差异; 太平洋亚历山大藻对有机磷源的选择具有一定的偏好性，对C—O—P键的有机磷利用效果明显好于对C—P键类的利用，这与含C—P键的膦酰类有机磷一般只能被蓝藻和细菌分解利用，而难以被真核类生物利用的结果一致[33-34]; 太平洋亚历山大藻对单酯类有机磷的利用效果要好于对双酯类，对核苷酸类、甘油类和葡萄糖类的有机磷也能充分利用，且明显优于磷酸类和氨基酸类有机磷。这可能是因为在磷缺失的情况下，藻细胞可分泌碱性磷酸酶来作用于大多数的单酯化合物，还能通过分泌核苷酸酶、磷酸甘油酶和葡萄糖磷酸酶等多种水解酶来利用不同类型的有机磷。由此可见，太平洋亚历山大藻能利用的有机磷源种类和数目均比较多，但其更倾向于优先利用含C—O—P键的有机磷和单酯类有机磷，核苷酸类、甘油类和葡萄糖类的有机磷也能被利用。当分别以SG-P和NaH2PO4为唯一磷源时，相同磷浓度下两者藻密度虽然无显著性差异，但SG-P培养下最大藻密度更高，且藻细胞生长状态更好，这与Ji等[35-36]的研究结果一致。表明太平洋亚历山大藻不仅具有利用有机磷进行生命活动的能力，而且对部分有机磷的利用效果要优于无机态磷酸盐，这与东海原甲藻和米氏凯伦藻利用有机磷的特点相似[37-38]。表明太平洋亚历山大藻在自然海水中可以利用的磷源非常广泛，使其引发有害藻华的潜在风险更大。
最大比生长速率μm表示细胞最大分裂速度的大小，可考察细胞的生长分裂能力，半饱和常数Kμ则可反映藻类对某种营养盐的适应程度。一般地，μm越大，Kμ越小，说明该营养盐越适合藻类的生长。本研究结果表明，分别以SG-P和NaH2PO4为磷源时，两组太平洋亚历山大藻的μm并没有显著性差异，表明二者对太平洋亚历山大藻的营养价值基本等同，但在SG-P条件下Kμ是在NaH2PO4条件下的0.78倍，这表明太平洋亚历山大藻对SG-P的适应程度更高，即更倾向于选择有机磷进行生长繁殖。
甲藻对磷的吸收利用有两种可能的途径: 一是在没有细胞水解酶的作用下直接吸收利用，另一种是经水解酶分解后吸收利用[39]。碱性磷酸酶作为一种非特异性酶，能将广泛的磷酸单酯，甚至短多聚磷酸链水解成无机磷[40-41]，这一结论已经在多种甲藻摄取有机磷的过程中得到证实[42-44]。本研究中以SG-P为磷源组时，太平洋亚历山大藻胞外碱性磷酸酶活性始终处于较低的水平，与无机磷条件下胞外酶活性变化趋势一致，这提示该磷源并没有在胞外被碱性磷酸酶水解而利用; 同时，其胞内碱性磷酸酶活性及变化趋势也与无机磷处理组无显著差异，说明藻细胞也没有在胞内利用碱性磷酸酶对SG-P进行水解转化。由此推测，太平洋亚历山大藻对SG-P的利用可能存在其他的利用途径，如利用其他特异性酶的水解，或像磷酸盐一样可被直接吸收利用，这有待进一步深入研究。此外，在磷缺乏组中，碱性磷酸酶的活性高度表达是因为在无机磷缺乏的环境中藻细胞会诱导合成碱性磷酸酶，从而分解水体中的有机磷或从环境中摄取更多的多聚磷酸盐以维持正常的生命活动[45]。
自然环境中的磷源类型可影响藻细胞合成毒素的种类。中国近海太平洋亚历山大藻复合种在不同环境下产毒具有差异: 第一类以低毒性N-磺酰胺甲酰基类(C1和C2)占绝对优势，其占比可超过90%;第二类以C1和C2为主，但有较高毒性的膝沟藻毒素(GTX1-4类)也占有较高的比例; 第三类则不产生C1和C2，而以GTX1-4类为主要毒素组分[46-49]。本研究以SG-P和NaH2PO4为磷源时，太平洋亚历山大藻产生的毒素均以低毒的C1和C2为主，其次为毒性较高的GTX1-4和GTX5，其他类型的毒素含量相对较低。本研究中无机磷源组检出了有机磷源组未检出的高毒性的氨基甲酸酯类毒素(STX和neoSTX)，可能是因为N-磺酰氨甲酰基类毒素在21位N原子上发生磺酸基脱落，转化为相应的氨基甲酸酯类毒素[50-51]，该转化过程受到温度、pH及营养盐等环境因素的影响[52]，导致PSTs的总毒性显著升高。这一结果表明，太平洋亚历山大藻更倾向于选择无机磷来完成毒素的合成与转化，且更有利于高毒性毒素的合成。
环境中的磷浓度与藻毒素的含量关系密切。很多研究表明，藻细胞内毒素含量随环境中磷浓度的升高而降低，磷限制可以导致亚历山大藻细胞内毒素含量显著增加[53-54]。本研究发现，在无磷条件下，单细胞毒素含量显著增加，其机制可能涉及两方面: (1)磷的限制会使藻细胞分裂活动减慢或停止，但胞内氮源充足仍可进行毒素的合成; (2)在磷限制条件下，藻细胞内氮的存在主要以铵盐为主，会一定程度上毒害藻细胞，从而激活精氨酸合成途径以进行应对，而精氨酸作为毒素合成的前体物质，进一步促进了毒素积累[56]。总之，太平洋亚历山大藻在磷缺乏的环境中会产生更多的毒素，并通过调节不同磷源及不同磷浓度条件下高毒性与低毒性藻毒素的种类和含量，形成了适应不同的营养环境而采取的生存策略，从而在缺磷环境下更具竞争优势。
4 结语太平洋亚历山大藻在磷限制的条件下能选择性利用多种有机磷维持正常的生命活动，对不同有机磷的选择具有差异性和偏好性，如更容易利用C—O—P键或单酯类的有机磷，对核苷酸类、葡萄糖类和甘油类的有机磷也能充分利用，且对部分有机磷的利用效率甚至优于无机磷; 碱性磷酸酶为太平洋亚历山大藻更高效地利用多种有机磷提供了可能，以此来应对磷限制对其生长的不利影响，但对SG-P的利用可能存在其他的途径。太平洋亚历山大藻在不同磷源下的毒素含量和组成均无显著性差异，均以低毒性的为主，但在磷限制条件下藻细胞毒素含量显著增加，可使低磷海域藻细胞PSTs的释放量增加，对海洋生态安全带来不利影响。综上，太平洋亚历山大藻可以通过调节细胞生长速率、酶活性、藻毒素种类和数量等多种生理功能应对环境中磷源的变化，形成了一套适应低磷环境的生存策略，从而使其能在磷限制条件下更具竞争优势，这进一步说明DOP可能在太平洋亚历山大藻赤潮形成过程中发挥着极为重要的作用。
| [1] |
Morse D, Tse S P K, Lo S C L. Exploring dinoflagellate biology with high-throughput proteomics[J]. Harmful Algae, 2018, 75: 16-26. DOI:10.1016/j.hal.2018.03.010 (  0) |
| [2] |
Luo H, Lin X, Li L, et al. Transcriptomic and physiological analyses of the dinoflagellate Karenia mikimotoi reveal non-alkaline phosphatase-based molecular machinery of ATP utilisation[J]. Environmental Microbiology, 2017, 19(11): 4506-4518. DOI:10.1111/1462-2920.13899 ( 0) |
| [3] |
Anderson D M, Alpermann T J, Cembella A D, et al. The globally distributed genus Alexandrium: Multifaceted roles in marine ecosystems and impacts on human health[J]. Harmful Algae, 2012, 14: 10-35. DOI:10.1016/j.hal.2011.10.012 ( 0) |
| [4] |
梁玉波, 李冬梅, 姚敬元, 等. 中国近海藻毒素及有毒微藻产毒原因种调查研究进展[J]. 海洋与湖沼, 2019, 50(3): 511-524. Liang Y B, Li D M, Yao J Y, et al. Research progress on pathogenic species of near-algal toxins and toxic microalgae in China[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2019, 50(3): 511-524. ( 0) |
| [5] |
于仁成, 吕颂辉, 齐雨藻, 等. 中国近海有害藻华研究现状与展望[J]. 海洋与湖沼, 2019, 51(4): 768-788. Yu R C, Lv S H, Qi Y Z, et al. Research status and prospect of harmful algal blooms in offshore China[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2019, 51(4): 768-788. ( 0) |
| [6] |
Sakamoto S, Lim W A, Lu D, et al. Harmful algal blooms and associated fisheries damage in East Asia: Current status and trends in China, Japan, Korea and Russia[J]. Harmful Algae, 2021, 102: 101787. DOI:10.1016/j.hal.2020.101787 ( 0) |
| [7] |
Karl D M. Aquatic ecology— Phosphorus, the staff of life[J]. Nature, 2000, 406(6791): 31-33. ( 0) |
| [8] |
Paytan A, McLaughlin K. The oceanic phosphorus cycle[J]. Chemical Reviews, 2007, 107(2): 563-576. DOI:10.1021/cr0503613 ( 0) |
| [9] |
Lin S, Litaker R W, Sunda W G. Phosphorus physiological ecology and molecular mechanisms in marine phytoplankton[J]. Journal of Phycology, 2016, 52(1): 10-36. DOI:10.1111/jpy.12365 ( 0) |
| [10] |
Tyrrell T. The relative influences of nitrogen and phosphorus on oceanic primary production[J]. Nature, 1999, 400(6744): 525-531. DOI:10.1038/22941 ( 0) |
| [11] |
Thingstad T F, Krom M D, Mantoura R, et al. Nature of phosphorus limitation in the ultraoligotrophic eastern Mediterranean[J]. Science, 2005, 309(5737): 1068-1071. DOI:10.1126/science.1112632 ( 0) |
| [12] |
Schindler D W, Hecky R E, Findlay D L, et al. Eutrophication of lakes cannot be controlled by reducing nitrogen input: Results of a 37-year whole-ecosystem experiment[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(32): 11254-11258. ( 0) |
| [13] |
Teikari J E, Fewer D P, Shrestha R, et al. Strains of the toxic and bloom-forming Nodularia spumigena (cyanobacteria) can degrade methylphosphonate and release methane[J]. ISME Journal, 2018, 12(6): 1619-1630. DOI:10.1038/s41396-018-0056-6 ( 0) |
| [14] |
Currie D J, Kalff J. Can bacteria outcompete phytoplankton for phosphorus? A chemostat test[J]. Microbial Ecology, 1984, 10(3): 205-216. DOI:10.1007/BF02010935 ( 0) |
| [15] |
Guisande C, Frangpulos M, Maneiro I, et al. Ecological advantages of toxin production by the dinoflagellate Alexandrium minutum under phosphorus limitation[J]. Marine Ecology Progress Series, 2002, 225: 169-176. DOI:10.3354/meps225169 ( 0) |
| [16] |
Dyhrman S T. Nutrients and Their Acquisition: Phosphorus Physiology in Microalgae[M]. Cham: Springer International Publishing, 2016: 155-183.
( 0) |
| [17] |
Dyhrman S T, Ruttenberg K C. Presence and regulation of alkaline phosphatase activity in eukaryotic phytoplankton from the coastal ocean: Implications for dissolved organic phosphorus remineralization[J]. Limnology and Oceanography, 2006, 51(3): 1381-1390. DOI:10.4319/lo.2006.51.3.1381 ( 0) |
| [18] |
Duhamel S, Dyhrman S T, Karl D M. Alkaline phosphatase activity and regulation in the North Pacific Subtropical Gyre[J]. Limnology and Oceanography, 2010, 55(3): 1414-1425. DOI:10.4319/lo.2010.55.3.1414 ( 0) |
| [19] |
VanMooy B A S, Fredricks H F, Pedler B E, et al. Phytoplankton in the ocean use non-phosphorus lipids in response to phosphorus scarcity[J]. Nature, 2009, 458(7234): 69-72. DOI:10.1038/nature07659 ( 0) |
| [20] |
Zhang S, Chen Y, Xie Z, et al. Unraveling the molecular mechanism of the response to changing ambient phosphorus in the dinoflagellate Alexandrium catenella with quantitative proteomics[J]. Journal of Proteomics, 2019, 196: 141-149. DOI:10.1016/j.jprot.2018.11.004 ( 0) |
| [21] |
Guillard R. R. L, Ryther J. H, et al. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea (Cleve) Gran[J]. Deep Sea Research and Oceanographic Abstracts, 1962, 9(7): 395. ( 0) |
| [22] |
肖宇梅, 徐雯钦, 苏玉萍, 等. 东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)利用有机磷增殖研究[J]. 渔业研究, 2019, 41(4): 278-283. Xiao Y M, Xu W Q, Su Y P, et al. Study on the proliferation of Prorocentrum donghaiense using organophosphorus[J]. Fisheries Research, 2019, 41(4): 278-283. ( 0) |
| [23] |
李春丽, 张前前, 王磊, 等. 应用吸光度比值法识别硅藻和甲藻[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2007, 37(S2): 161-164. Li C L, Zhang Q Q, Wang L, et al. Identification of diatoms and dinoflagellates by absorbance ratio method[J]. Periodical of Ocean University of China, 2007, 37(S2): 161-164. DOI:10.16441/j.cnki.hdxb.2007.s2.029 ( 0) |
| [24] |
蔡卓平, 段舜山, 朱红惠. 三角褐指藻在多波长下藻液吸光度与细胞密度的关系研究[J]. 广东药学院学报, 2012, 28(6): 608-611. Cai Z P, Duan S S, Zhu H H. Study on the relationship between the absorbance of algal fluid and cell density of Phaeodactyla triangulata under multi-wavelength conditions[J]. Journal of Guangdong Pharmaceutical University, 2012, 28(6): 608-611. ( 0) |
| [25] |
Lwoff A. Recherches sur la croissance des cultures bacteriennes[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 1960, 1(2): 182. DOI:10.1016/0010-406X(60)90054-2 ( 0) |
| [26] |
Ou L, Huang X, Huang B, et al. Growth and competition for different forms of organic phosphorus by the dinoflagellate Prorocentrum donghaiense with the dinoflagellate Alexandrium catenella and the diatom Skeletonema costatum s[J]. Hydrobiologia, 2015, 754(1): 29-41. DOI:10.1007/s10750-014-1994-2 ( 0) |
| [27] |
张亚亚, 闫国旺, 吴海燕, 等. 基于SPE与SPATT的水体中麻痹性贝类毒素检测方法构建与应用[J]. 海洋与湖沼, 2019, 51(2): 298-306. Zhang Y Y, Yan G W, Wu H Y, et al. Construction and application of a method for detecting paralytic shellfish toxins in water based on SPE and SPATT[J]. Ocean and Limnology, 2019, 51(2): 298-306. ( 0) |
| [28] |
吴海燕, 郭萌萌, 邴晓菲, 等. 液相色谱-四极杆/线性离子阱复合质谱测定双壳贝类中麻痹性贝类毒素[J]. 海洋与湖沼, 2017, 48(3): 508-515. Wu H Y, Guo M M, Bing X F, et al. Determination of paralytic shellfish toxins in bivalves by liquid chromatography-quadrupole/linear ion trap combined mass spectrometry[J]. Oceanology and Limnology, 2017, 48(3): 508-515. ( 0) |
| [29] |
Li H, Tang H, Shi X, et al. Increased nutrient loads from the Changjiang (Yangtze) River have led to increased harmful algal blooms[J]. Harmful Algae, 2014, 39: 92-101. DOI:10.1016/j.hal.2014.07.002 ( 0) |
| [30] |
Yu Z, Tang Y, Gobler C J. Harmful algal blooms in China: History, recent expansion, current status, and future prospects[J]. Harmful Algae, 2023, 129: 102499. DOI:10.1016/j.hal.2023.102499 ( 0) |
| [31] |
Wang Z, Liang Y, Kang W. Utilization of dissolved organic phosphorus by different groups of phytoplankton taxa[J]. Harmful Algae, 2011, 12: 113-118. DOI:10.1016/j.hal.2011.09.005 ( 0) |
| [32] |
Young C L, Ingall E D. Marine dissolved organic phosphorus composition: Insights from samples recovered using combined electrodialysis/reverse osmosis[J]. Aquatic Geochemistry, 2010, 16(4): 563-574. DOI:10.1007/s10498-009-9087-y ( 0) |
| [33] |
Ren L, Wang P, Wang C, et al. Algal growth and utilization of phosphorus studied by combined mono-culture and co-culture experiments[J]. Environmental Pollution, 2017, 220: 274-285. DOI:10.1016/j.envpol.2016.09.061 ( 0) |
| [34] |
胡芳, 许振成, 姚玲爱, 等. 剑潭水库浮游植物群落特征与水环境因子关系研究[J]. 环境科学学报, 2014, 34(4): 950-958. Hu F, Xu Z C, Yao A L, et al. Relationship between phytoplankton community characteristics and water environmental factors in Jiantan Reservoir[J]. Chinese Journal of Environmental Sciences, 2014, 34(4): 950-958. ( 0) |
| [35] |
Ji N, Wang J, Zhang Z, et al. Transcriptomic response of the harmful algae Heterosigma akashiwo to polyphosphate utilization and phosphate stress[J]. Harmful Algae, 2022, 117: 102267. DOI:10.1016/j.hal.2022.102267 ( 0) |
| [36] |
Yang Y, Shi J, Jia Y, et al. Unveiling the impact of glycerol phosphate(DOP) in the dinoflagellate Peridinium bipes by physiological and transcriptomic analysis[J]. Environmental Science Europe, 2020, 32(1): 38. DOI:10.1186/s12302-020-00317-6 ( 0) |
| [37] |
Oh S J, Yamamoto T, Kataoka Y, et al. Utilization of dissolved organic phosphorus by the two toxic dinoflagellates, Alexandrium tamarense and Gymnodinium catenatum (Dinophyceae)[J]. Fisheries Science, 2002, 68(2): 416-424. DOI:10.1046/j.1444-2906.2002.00440.x ( 0) |
| [38] |
史竞园, 刘云, 张樱馨, 等. 不同氮源、磷源对链状裸甲藻生长与酶活性的影响[J]. 海洋与湖沼, 2023, 54(4): 1048-1057. Shi J Y, Liu Y, Zhang Y X, et al. Effects of different nitrogen and phosphorus sources on the growth and enzyme activity of Gymnodinium streptiformis[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2023, 54(4): 1048-1057. ( 0) |
| [39] |
Hernndez I, Niell F X, Whitton B A. Phosphatase activity of benthic marine algae: An overview[J]. Journal of Applied Phycology, 2002, 14(6): 475-487. DOI:10.1023/A:1022370526665 ( 0) |
| [40] |
Hoppe H G. Phosphatase activity in the sea[J]. Hydrobiologia, 2003, 493(1-3): 187-200. DOI:10.1023/A:1025453918247 ( 0) |
| [41] |
Ren L, Wang P, Wang C, et al. Algal growth and utilization of phosphorus studied by combined mono-culture and co-culture experiments[J]. Environmental Pollution, 2017, 220: 274-285. DOI:10.1016/j.envpol.2016.09.061 ( 0) |
| [42] |
Luo H, Lin X, Li L, et al. Transcriptomic and physiological analyses of the dinoflagellate Karenia mikimotoi reveal non-alkaline phosphatase-based molecular machinery of ATP utilisation[J]. Enviromental Microbiology, 2017, 19(11): 4506-4518. ( 0) |
| [43] |
Huang B Q, Ou L J, Hong H S, et al. Bioavailability of dissolved organic phosphorus compounds to typical harmful dinoflagellate Prorocentrum donghaiense Lu[J]. Marine Pollution Bulletin, 2005, 51(8-12): 838-844. DOI:10.1016/j.marpolbul.2005.02.035 ( 0) |
| [44] |
Zhang S, Yuan C, Chen Y, et al. Transcriptomic response to changing ambient phosphorus in the marine dinoflagellate Prorocentrum donghaiense[J]. Science of the Total Enviromental, 2019, 692: 1037-1047. DOI:10.1016/j.scitotenv.2019.07.291 ( 0) |
| [45] |
Bai F, Liu R, Yang Y, et al. Dissolved organic phosphorus use by the invasive freshwater Diazotroph cyanobacterium, Cylindrospermopsis raciborskii[J]. Harmful Algae, 2014, 39: 112-120. DOI:10.1016/j.hal.2014.06.015 ( 0) |
| [46] |
于仁成, 罗璇. 我国近海有毒藻和藻毒素的研究现状与展望[J]. 海洋科学集刊, 2016, 51: 155-166. Yu R C, Luo X. Research status and prospect of toxic algae and algal toxins in offshore waters of China[J]. Marine Science Journal, 2016, 51: 155-166. ( 0) |
| [47] |
Wang D Z, Hsieh D. Growth and toxin production in batch cultures of a marine dinoflagellate Alexandrium tamarense HK9301 isolated from the South China Sea[J]. Harmful Algae, 2005, 4(2): 401-410. DOI:10.1016/j.hal.2004.07.002 ( 0) |
| [48] |
Wang D, Lin L, Gu H, et al. Comparative studies on morphology, ITS sequence and protein profile of Alexandrium tamarense and A. catenella isolated from the China Sea[J]. Harmful Algae, 2008, 7(1): 106-113. DOI:10.1016/j.hal.2007.06.002 ( 0) |
| [49] |
Gu H, Zeng N, Liu T, et al. Morphology, toxicity, and phylogeny of Alexandrium (Dinophyceae) species along the coast of China[J]. Harmful Algae, 2013, 27: 68-81. DOI:10.1016/j.hal.2013.05.008 ( 0) |
| [50] |
Turriff N, Runge J A, Cembella A D. Toxin accumulation and feeding behaviour of the planktonic copepod Calanus finmarchicus exposed to the red-tide dinoflagellate Alexandrium excavatum[J]. Marine Biology, 1995, 123(1): 55-64. DOI:10.1007/BF00350323 ( 0) |
| [51] |
Ding L, Qiu J, Li A. Proposed biotransformation pathways for new metabolites of paralytic shellfish toxins based on field and experimental mussel samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(27): 5494-5502. DOI:10.1021/acs.jafc.7b02101 ( 0) |
| [52] |
Tan K S, Ransangan J. Factors influencing the toxicity, detoxification and biotransformation of paralytic shellfish toxins[J]. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 2015, 235: 1-25. ( 0) |
| [53] |
Xu J, Ho A Y T, He L, et al. Effects of inorganic and organic nitrogen and phosphorus on the growth and toxicity of two Alexandrium species from Hong Kong[J]. Harmful Algae, 2012, 16: 89-97. DOI:10.1016/j.hal.2012.02.006 ( 0) |
| [54] |
Tang Y Z, Kong L, Holmes M J. Dinoflagellate Alexandrium leei (Dinophyceae) from Singapore coastal waters produces a water-soluble ichthyotoxin[J]. Marine Biology, 2007, 150(4): 541-549. ( 0) |
| [55] |
张清春. 氮、磷营养物质与微生物对微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)生长和毒素产生的影响[D]. 青岛: 中国科学院研究生院(海洋研究所), 2004: 152-156. Zhang Q C. Effects of Nitrogen and Phosphorus Nutrients and Microorganisms on the Growth and Toxin Production of Alexandrium minutum[D]. Qingdao: Graduate School of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, 2004: 152-156. ( 0) |
2. Weihai Huihai Marine Science and Technology Limited Company, Weihai 264400, China;
3. Fourth Marine Institute, Ministry of Natural Resources, Beihai 536015, China;
4. Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China;
5. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China