2025, Vol. 55
2. 中国海洋大学化学化工学院, 山东 青岛 266100;
3. 青岛海洋科技中心海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266237
氮是海洋中最重要的生源要素之一，是构成海洋生态系统的重要物质基础[1-2]，往往是海洋初级生产力的关键限制元素，决定了海洋生物泵的固碳效率和表层海洋碳输出通量的大小，是大气中温室气体浓度变化的重要驱动力[3-4]。海洋氮循环过程主要包括固氮作用、同化作用、硝化作用、矿化作用、反硝化作用、厌氧氨氧化作用等[5]。硝化是海洋水体氮循环的重要过程，影响着水体内部氮的存在形式和转化过程[6-7]。硝化作用可以将氨转化为硝酸盐，由氨氧化与亚硝酸盐氧化两个步骤组成[8-9]。氨首先被氨氧化古菌(Ammonia oxidizing archaea，AOA)与氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria，AOB)氧化为亚硝酸盐[10-11]，之后被亚硝酸盐氧化菌(Nitrite oxidizing bacteria，NOB)进一步氧化为硝酸盐[8]。在全球范围内，真光层中发生的硝化作用可以供给大约一半的浮游植物生长所需的硝酸盐[7]。
黄渤海是中国传统的近海渔场所在地，同时也是受高强度人为活动影响的典型半封闭边缘海，与外海水体交换周期长，交换能力弱，自净能力较差，易导致营养物质的累积[12-14]。近四十年来，黄渤海水体的氮营养盐含量显著上升，且渤海氮磷比显著偏离Redfield比值[15-17]，诸如赤潮，浒苔绿潮等生态灾害在该海区频发[18-22]。以往对黄渤海营养盐的研究表明，外源性的输入，如河流输入、陆地径流以及大气沉降对于这两个海区的营养盐收支起着重要作用[15, 23-24]。然而，对于这些外源性的营养盐，尤其是氮营养盐进入黄渤海后所发生的内部转化过程研究仍较为缺乏，硝化过程对于水体中氮的形态转化与内部收支影响尚不清晰。因此，了解黄渤海硝化速率的分布并甄别其关键受控因子，对解读黄渤海氮的生物地球化学过程尤为重要。
本研究于2021年5—6月在渤海和北黄海开展了现场观测，通过开展一系列加富15N的培养实验，量化黄渤海各区域硝化作用的速率，并通过控制加富15N底物浓度和光照强度等定量分析光照、底物浓度与硝化作用的关系，为进一步研究黄渤海氮循环其他过程，以及改善与治理黄渤海水体环境提供了理论参考。
1 材料与方法 1.1 研究区域与样品采集于2021年5—6月搭乘“中渔科102”号渔业资源调查船对渤海和北黄海开展了观测，共在10个站位开展了水体样品采集和现场受控培养实验(见图 1)。在每个站位采用船载CTD系统(Seabird 25 Plus，美国)自带的探头测定水柱的温度、盐度、溶解氧(DO)浓度以及叶绿素a浓度等基本参数，同时利用Niskin采水器采集不同层次水样用于营养盐、硝酸盐天然氮氧同位素的测定以及15N添加受控培养实验(见表 1)。在6894站测量海水透明度以估算真光层深度。
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图 1 调查取样站位图 Fig. 1 Sampling stations |
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表 1 春季黄渤海的天然硝酸盐氮氧同位素值、温度、盐度、溶解氧、叶绿素a与含氮营养盐浓度 Table 1 Nitrogen and oxygen isotope, temperature, salinity, DO, chlorophyll a, nitrate, nitrite and ammonium of the Yellow Sea and Bohai Sea in spring |
营养盐、硝酸盐天然氮氧同位素样品采集后使用Nalgene滤器过滤。水体各层次营养盐与硝酸盐天然氮氧同位素样品均使用GF/F滤膜(经450 ℃灼烧4 h)过滤，滤液分装于洁净的125 mL高密度聚乙烯样品瓶中，置于-20 ℃冰箱中冷冻保存，用于后续样品的测定。为准确量化15N加富培养实验中15NH4+的加入量，每个层次的样品在采集后立即采用50 mL塑料离心管进行分样，现场测定本底的NH4+含量。
1.2 水体硝化速率测定的15N加富培养实验对于培养站位各层次，利用Niskin采水器所采集40~50 L海水，在培养前预先使用200 μm孔径筛绢过滤以去除大型浮游动物等的影响。在所有站位现场测定水体氨氮浓度，根据现场测定结果及历史数据，加富15NH4+，使其浓度达到海水本底的10%~20%。将加富海水分装入1 000 mL聚碳酸酯培养瓶中，放入不同透光率的光培养箱中，使用循环表层海水模拟原位温度进行培养6~10 h。所有培养均开展了2~3组平行。雾天、阴雨和夜晚的培养在具有人工光源(Apollo 10全光谱节能植物灯)的帐篷中进行，利用光合有效辐射探头(MQ-500，Apogee，美国)测定光培养箱的光合有效辐射强度。培养前后水样的过滤与保存条件同上述天然水样。此外，记录培养当天的日照时间。为了验证在所选定的培养时间内硝化速率是否稳定，选取5984站和294站表底层水样开展了时间序列的培养实验，每个实验的取样时间间隔为2~4 h。
为了探究底物对于硝化速率的影响，采用上述同样的培养方式分别在5594站，3594站，3794站和2551站进行了添加不同15NH4+浓度系列的培养实验，15NH4+添加浓度系列设定为0.05，0.1，0.3和2.0 μmol·L-1。
此外，为了探究光照强度对于硝化速率的影响，采用上述同样的培养方式利用6894站真光层底部水体开展了控制光照梯度的培养，光照梯度设定为表层光强的0%，1%，20%，50%和100%。同时，在各站表层水开展光暗对照培养实验。
1.3 样品分析方法硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐、硅酸盐样品使用连续流动分析仪(QuAAtro，SEAL，德国)测定，测定方法分别为镉-铜还原+重氮偶氮法、重氮偶氮法、磷钼蓝法、硅钼蓝法[25]。上述方法检测限分别为0.01，0.01，0.01和0.04 μmol·L-1，精密度优于2%。现场测定的氨氮使用荧光法[26-27]测定，该方法检测限为0.006 μmol·L-1，精密度为1.7%。
天然与加富硝酸盐氮氧同位素样品使用同位素比值质谱(IRMS, IsoPrime 100，Elementar，德国)测定，测定方法为反硝化细菌法[28]，测定时天然硝酸盐氮氧同位素时加入了盐酸-氨基磺酸以去除亚硝酸盐的影响，测定中使用的国际稳定同位素标准与实验室自制工作标准如表 2所示，本方法可以准确测定0.5 μmol·L-1以上的硝酸盐样品。对于硝酸盐浓度低于0.5 μmol·L-1的加富培养样品，由于其15N同位素丰度较高，在测样时按照9∶1的比例添加了5 μmol·L-1的15N标准，之后根据质量守恒定律计算样品的氮同位素丰度[29]。本方法测定δ15N-NO3-的精密度优于0.2‰，测定δ18O-NO3-的精密度优于0.5‰，硝化速率检出限为0.01 nmol·L-1·d-1。
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表 2 使用的氮氧同位素标准及其真实值 Table 2 Theoretical values of stable nitrogen and oxygen isotopes in the standard substances |
硝化速率的计算公式为
| $ R=\frac{\left(R_{\mathrm{T}} \times C_{\mathrm{T}}\right)-\left(R_0 \times C_0\right)}{t} \times \frac{{ }^{14} N+{ }^{15} N}{{ }^{15} N} 。$ | (1) |
式中：R为硝化速率，单位nmol·L-1·h-1；t为培养时间，单位h；R0、RT分别为培养前后15NOx-浓度与总的NOx-浓度的比值；C0、CT分别为培养前后水体硝酸盐的浓度，单位nmol·L-1；14N、15N分别为水体本底氨氮浓度与加富15NH4+浓度，单位nmol·L-1。由于NO2-占NOx-浓度的比例平均不足3%(见表 1)，所以以NOx-的变化情况来计算硝化速率。
水体表层日硝化速率按照光培养结果与暗培养结果的平均值计算(春季日照时间和黑暗时间基本相等)，计算公式为
| $ R_{\text {day }}=\left(R_{\text {light }}+R_{\text {dark }}\right) \times 12 \text { 。} $ | (2) |
式中：Rday为硝化日速率，单位nmol·L-1·d-1；Rlight为光培养下每小时硝化速率，单位nmol·L-1·h-1；Rdark为暗培养下每小时硝化速率，单位nmol·L-1·h-1。
底层水硝化日速率以暗培养结果计算，计算公式为
| $ R_{\text {day }}=R_{\text {dark }} \times 24 \text { 。} $ | (3) |
硝化速率与底物氨浓度的关系采用米氏方程[30]进行拟合，
| $ { }^{15} R=\frac{R_{\mathrm{m}} \times C}{K_{\mathrm{m}}+C}。$ | (4) |
式中：15R为以15N计算的硝化速率，即15NH4+的氧化速率，单位nmol·L-1·h-1；C为加富的15NH4+浓度，单位μmol·L-1；Rm为最大硝化速率，单位nmol·L-1·h-1；Km为硝化的半饱和常数，单位μmol·L-1。
硝化速率与光照强度的关系采用Varela等的方程进行拟合[31]，
| $ R=R_{\mathrm{m}} \times\left(1-\frac{I_{\mathrm{m}} \times I}{K_{\mathrm{I}}+I}\right)。$ | (5) |
式中：I为光照强度，单位μmol·m-2·s-1；Im为硝化速率的最大抑制比例，范围是0~1；KI为半抑制常数，即R为Rm一半时对应的光强，单位μmol·m-2·s-1。
光对硝化作用的抑制率计算公式为
| $ R_{\mathrm{I}}=\frac{R_{\mathrm{dark}}-R_{\mathrm{light}}}{R_{\mathrm{dark}}} \times 100 \%。$ | (6) |
式中RI为光对硝化作用的抑制率，单位%。
硝化速率与底物浓度和光照强度之间的拟合以及硝化速率与水体环境因子之间的相关性矩阵热图采用Origin 2021软件实现，显著性水准选取p=0.05。硝化速率的分布图采用Ocean Data View 5.6.7绘制。
2 结果与讨论 2.1 黄渤海春季天然硝酸盐氮氧同位素的分布春季黄渤海硝酸盐浓度为0.06~15.78 μmol·L-1，平均浓度为(4.20±5.03) μmol·L-1。受方法与仪器检测限限制，仅测定了硝酸盐浓度高于0.5 μmol·L-1的样品的氮氧同位素。δ15N-NO3-分布范围为8.6‰~14.5‰，平均为(11.6±1.9)‰，低值出现在北黄海中部底层和黄河口，高值出现在渤海中部和辽东湾。δ18O-NO3-分布范围为7.2‰~23.4‰，平均为(15.9±5.2)‰，低值出现在黄河口，高值出现在渤海湾和辽东湾(见表 1)。
除5083站位表层外，其余所有样品均能观测到δ18O显著高于δ15N。同时，调查站位所有层次水样均未发现低氧现象(见表 1)，这说明硝化作用广泛存在于在黄渤海的水体。硝化作用会导致氮氧同位素的分馏，更轻的14N与16O被氨氧化菌优先利用，形成了“更轻”的硝酸盐，导致硝酸盐δ15N与δ18O的降低，一般来说，δ15N的下降更大，δ18O往往大于δ15N，这也是利用天然硝酸盐氮氧同位素示踪硝化过程的依据[32]。而浮游植物等对硝酸盐的同化过程往往优先利用更轻的14N与16O，导致水体剩余的硝酸盐“更重”[5, 32]。除3794站外，相较于辽东湾等近岸区域，黄渤海中部的δ15N与δ18O值更低，这可能表明，在辽东湾等近岸区域，硝化过程与氮吸收过程存在耦合，尤其是浮游植物对氨的吸收，将与硝化过程竞争底物。近岸区域氮吸收过程抑制了硝化过程，所以使得相较于近岸区域，黄渤海中部的氮和氧“偏轻”。
2.2 黄渤海春季硝化速率的分布在讨论黄渤海水体硝化速率之前，我们首先利用时间序列的培养实验验证在设定的培养时间范围内所获取的硝化速率是否稳定。结果表明，对于两个站位表底层样品来说，15NOx-的产生量随着培养时间呈现线性增长的规律，所有样品的回归决定系数r2均高于0.95，且回归斜率的波动处于5%~20%(见图 2)，平均13%，说明本文所选取的培养时间内硝化速率是稳定的。
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(
 表层, 光培养;  表层, 暗培养;  底层, 光培养。a.5984站；b.294站。纵轴为培养前后15NO3-的变化量，横轴为培养时间。k和r2分别为线性回归斜率和决定系数。误差棒代表培养样品的标准偏差。Surface, light inculbation; Surface, dark inculbation; Bottom, dark inculbation. The observational data for 15NO3-, a. Station 5984; b. Station 294. k and r2 represent the slope of linear regression and coefficient of determination. Error bars represent standard deviation of samples.
)
图 2 时间序列培养结果 Fig. 2 The change in 15NO3- after incubation versus incubation time |
春季黄渤海的硝化速率如图 3所示。渤海的硝化速率为0.11~2.62 nmol·L-1·d-1，北黄海为0.06~2.56 nmol·L-1·d-1，渤海硝化速率高于北黄海。分区域看，在春季的渤海和北黄海，邻近河口的硝化速率最高，黄渤海中部海区(远海)次之，近岸区域，如海湾等最低。河口由于存在陆源输入，营养盐与颗粒物浓度高，既给硝化提供了充足的底物，也为亲颗粒的氨氧化菌提供了良好的生存环境[33-37]，这都有助于硝化速率的提升。对位于莱州湾的6251站和位于辽东湾的294站表层水进行光培养后，均观测不到硝化产物的累积，近岸较低的硝化速率可能与氮吸收过程的竞争有关。渤海海湾站位的叶绿素a平均浓度是渤海中部的近一倍(见表 1)，这表明浮游植物在海湾有着更高的丰度，更多的浮游植物进行的更强的同化吸收过程与硝化作用间会产生强烈的底物竞争[38]，在近岸区域氮吸收作用与硝化作用间存在深度关联。
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图 3 春季黄渤海硝化速率分布 Fig. 3 Nitrification rate in the Yellow Sea and Bohai Sea in spring |
分层次来看，除了位于黄河口的5083站外，所有底层水中的硝化速率均高于表层。一方面，表层受光照影响，硝化过程受到抑制(详见2.3.2)，而黄渤海真光层深度一般在10 m左右[39]，底层水均处于黑暗环境；另一方面，由于水动力过程，沉积物再悬浮等会提高水体的颗粒物浓度，有利于亲颗粒性的氨氧化菌生长。此外，部分区域表、底层水团间也有所差异。在春季的北黄海底层，黄海冷水团并未完全消散[40]，5984和5594站底层水温仅8~9 ℃，均处在黄海冷水团中。有关黄海冷水团的天然硝酸盐氮氧同位素研究表明，水团中的硝酸盐主要受硝化过程控制，且硝化作用造成了水团硝酸盐的累积[41]；王文涛[42]利用同位素稀释效应估算了春季黄海冷水团中的硝化速率，显著高于表层水中的硝化速率。因此说明，水团差异可能同样导致5984和5594两站底层水硝化速率更高。
与其他大陆边缘海相比，春季黄渤海的硝化速率处于较低水平，比波罗的海[43]和西北地中海[44]要低1~2个数量级，略高于南海[45]。这可能主要与底物浓度有关。黄渤海观测到的氨浓度更低，是波罗的海和西北地中海浓度水平的1/10—1/5，而南海的氨浓度较黄渤海要更低。
2.3 黄渤海硝化过程的主要控制因子 2.3.1 底物浓度观测区域氨浓度为0.04~1.24 μmol·L-1，平均浓度为(0.63±0.32) μmol·L-1。黄渤海暗环境中硝化速率为0.07~3.69 nmol·L-1·d-1，平均速率为(1.74±1.26) nmol·L-1·d-1。在部分站位开展的15NH4+浓度梯度加富实验结果同样表明，硝化速率与海水氨浓度间符合米氏方程关系(见图 4)。对各站位、层次水体的15NH4+加富浓度与15NH4+硝化速率进行拟合，得到的底物动力学参数(最大硝化速率Rm、半饱和常数Km)如表 3所示，黄渤海硝化的Rm为0.002~0.269 nmol·L-1·h-1，Km为0.02~23.19 μmol·L-1。所有站位表层均观测到了光照条件下具有更小的Rm和更大的Km，这表明光照下硝化作用的潜在最大速率更低，且在较低底物水平时，硝化作用的竞争力更弱。分层次来看，底层水Rm比表层水更大，底层硝化速率的潜能更高，这同样可能是由光照调控的。
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(
 表层, 光培养； 表层, 暗培养； 底层, 光培养。a. 5594站；b. 3594站；c.2551站；d. 3794站。Surface, light inculbation; Surface, dark inculbation; Bottom, dark inculbation. a. Station 5594; b. Station 3594; c. Station 2551; d. Station 3794.
)
图 4 以15N计算的硝化速率的底物氨浓度梯度培养结果 Fig. 4 The dependence of 15N oxidation rates on substrate concentration |
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表 3 底物动力学实验拟合参数 Table 3 Rm, Km of nitrification kinetics for NH4+ based on 15N flow |
此外，暗环境硝化速率与海水氨浓度同样符合米氏方程关系(见图 5)，拟合得到的Rm = (8.04±4.80) nmol·L-1·d-1，Km=(1.34±1.18) μmol·L-1(r2=0.70，p < 0.05)，这表明氨浓度显著调控了春季黄渤海的硝化过程。
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图 5 暗培养下水体氨浓度与硝化速率间的关系 Fig. 5 The relationship between ammonia concentration and nitrification rate during dark incubation |
对6894站真光层底部水体开展了控制光照梯度的培养，结果表明，随着光照强度的增加，水体硝化速率逐渐降低，且二者关系符合米氏方程的变形(见图 6)。其最大硝化速率Rm=(0.06±0.01) nmol·L-1·h-1，半抑制常数KI=(251±16) μmol·m-2·s-1(r2=0.936)。此外，对各站表层水开展的光暗对照培养实验结果表明(见图 7)，在黄渤海，光对硝化作用的抑制率为4.9%~91.0%，平均为52.7%，其中渤海平均抑制率为59.8%，北黄海平均抑制率为43.2%。光对黄渤海的硝化过程存在普遍的抑制作用，这与在加利福尼亚湾、热带东北太平洋、珠江口等多地的观测结果一致[46-47]。
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图 6 不同光照强度下6894站真光层底部的硝化速率 Fig. 6 Nitrification rate at the bottom of the euphotic zone at station 6894 under different photosynthetically active radiation |
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图 7 光、暗环境中表层海水的硝化速率与光照对硝化作用的抑制率 Fig. 7 Nitrification rate of surface water in light and dark environments and the inhibition ratio of nitrification by light |
光照对于硝化过程的抑制，一方面在于光照直接抑制氨氧化菌的活性[48]，且海洋中氨氧化菌的分布往往受光抑制控制[49-50]；另一方面在于光照促进了氨的吸收过程，氨吸收过程与硝化过程间互相竞争底物，进而抑制了硝化过程[38, 51-52]，在光照充足的海水表层，硝化速率往往低于检测限[46]。
2.3.3 其他环境因子对春季黄渤海日硝化速率(Rday)与温度、盐度、溶解氧浓度、叶绿素a浓度、营养盐、光合有效辐射强度进行Pearson相关性分析(见图 8)，结果表明，硝化日速率与上述环境因子间均无显著的相关性，尤其是硝化速率与海水氨浓度间无显著相关。相较于暗环境中黄渤海的硝化速率与海水氨浓度间符合米氏方程关系，日硝化速率与海水氨浓度间无显著相关性可能是由光照导致的。一方面光照显著抑制了表层的硝化过程，另一方面光照刺激了表层浮游植物对氨的吸收，强化了对硝化作用底物的竞争。
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图 8 春季黄渤海日硝化速率与环境参数的Pearson相关性分析 Fig. 8 Pearson correlation analysis of daily nitrification rate and environmental parameters in the Yellow Sea and Bohai Sea in spring |
一般而言，温度会影响海水的硝化速率，在南大西洋的研究表明[53]，硝化速率在25 ℃时达到最大值。Zheng等[45]在从九龙江口到南海北部的研究中发现，温度增加会抑制近海的氨氧化速率。本研究并未观测到海水温度与硝化速率间的相关性，这可能与培养时采用表层海水循环控温有关，实际培养温度与原位环境的海水温度存在差异。
盐度对硝化速率的影响主要在河口区域表现，淡水端的氨浓度更高，使得水体硝化速率更高[36]，本研究培养站位间盐度跨度较小，较难直接找到盐度与硝化速率的相关性。
硝化作用需要氧气的参与，在缺氧水体中硝化过程将受到抑制。当溶解氧浓度为1.1~6.2 μmol·L-1时, 氨氧化作用会受到显著抑制[54]。Peng等[55]在热带东太平洋的研究发现，溶解氧浓度与硝化速率间的关系符合米氏方程，且当溶氧浓度高于200 μmol·L-1时，硝化速率基本稳定不变。本研究并未观测到水体的缺氧现象，且溶氧浓度波动较小，与硝化速率间的关系不显著。
叶绿素a浓度主要反应浮游植物丰度，叶绿素a浓度越高，浮游植物丰度越高，对氨的吸收作用也越强。正如前文所述6251站与294站的培养结果，氮吸收过程与硝化作用存在深度关联。而叶绿素a浓度与硝化速率并未发现相关性，预示着氮吸收过程与硝化作用的关系较为复杂，难以直接通过Pearson相关性分析表现。
3 结语春季渤海水体的硝化速率为0.11~2.62 nmol·L-1·d-1，北黄海为0.06~2.56 nmol·L-1·d-1。渤海硝化速率高于北黄海，河口的硝化速率最高，黄渤海中部海区次之，近岸区域最低，这与底物氨的浓度与浮游植物对氨的竞争有关。黄渤海底层硝化速率高于表层。
春季黄渤海硝化过程主要受光照和氨浓度调控，与温度、盐度、溶氧浓度、叶绿素a浓度等环境因子间无显著相关。其中，光照强度对黄渤海的硝化过程存在抑制作用，光强与硝化速率间的关系符合抑制的动力学特点。在表层，光照对硝化作用的抑制率为4.9%~91.0%。春季黄渤海的硝化速率与水体氨浓度间符合米氏方程关系，硝化速率随氨浓度的升高而增加。
受限于航次安排和实验技术手段，本研究未关注黄渤海的氮吸收过程，对硝化过程的两个步骤，即氨氧化和亚硝酸盐氧化也未进行细分研究，对这些精细化过程速率的测定以及影响因素的研究可能对水体氮循环提供更为丰富信息。
致谢: 本研究CTD数据及样品均采集自黄海水产研究所和青岛海洋科学技术试点国家实验室深远海科学考察队共同组织的黄渤海渔业资源调查共享航次“中渔科102”号渔业资源调查船，硝酸盐氮氧同位素由海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室大型仪器技术服务中心徐文琦实验师协助测定，在此致以诚挚的谢意！
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