2025, Vol. 55
1. 中国海洋大学三亚海洋研究院 海南省热带水产种质重点实验室, 海南 三亚 572025
扇贝是中国海水养殖贝类之一，是中国蓝色粮仓的重要组成部分。栉孔扇贝(Chlamys farreri)是中国特有的重要扇贝经济物种，具备雌雄异体且性别稳定的特点，是研究双壳贝类雌、雄性腺发育很有优势的材料。贝类性腺发育和两性配子发生是一系列关键基因差异表达的结果，如foxl2、drmt1、klf4和sox2等已被证实参与这些生物学过程[1-5]，而这些基因的表达在转录及转录后水平上又受到转录因子和微小RNA(microRNA, miRNA)的调控[6-7]。目前已有多篇文献报道miRNA可能在贝类性腺发育中发挥重要的作用[8-11]。
miRNA是体内调控基因表达的重要工具之一，它的作用在各物种中相对保守，都是通过自身特殊的种子序列，特异性识别靶基因的3’UTR或CDS区域[12-13]，并招募Argonaute等蛋白形成RISC复合物，再切割mRNA或抑制转录后翻译，进而阻止基因的表达[14-15]。miRNA已被报道参与生物发育过程中一系列过程，包括造血过程、免疫、细胞的增殖及凋亡，甚至是肿瘤的发生。同样的，miRNA也被报道参与配子的发育过程。例如: 在小鼠(Mus musculus)中，当参与miRNA加工的Dicer酶在生殖细胞中被敲除时，其精子发生会被中断[16-17]; miR-21、miR-10a、miR-469和miR-146等都被报道参与了配子发生的各个过程[18-21]。
本课题组以往研究中已发现在栉孔扇贝性别初始分化发育阶段存在11个具有显著雌雄差异的miRNAs，其中包括在雌性性腺中高表达而在雄性性腺中低表达的miR-375_1[7]。已有的文献报道中，miR-375被认为是肿瘤抑制因子[22]，它在肿瘤细胞如卵巢癌细胞中低表达[23]。miR-375在维持胰腺的功能中也发挥重要作用[24]。此外，还有研究发现miR-375在不同物种性腺发育中发挥了重要的作用。例如miR-375可以调节猪(Sus scrofa)卵巢颗粒细胞中雌二醇(Estradiol, E2)的产生[25]; 当敲降长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)体内miR-375时会导致卵的孵化率降低[26]; 在猪的精巢中miR-375可以通过调控higd1A基因调节支持细胞的活性氧(ROS)含量以及细胞凋亡[27-28]; miR-375的表达还会受到雄激素诱导作用的影响[29]。然而，除了本课题组以往研究[7]中发现miR-375_1在栉孔扇贝性腺中具备雌雄差异表达并暗示其参与性腺发育外，目前在贝类及近缘物种中尚未有针对miR-375_1调控贝类性别发育或性腺发育的相关研究报道。
廖承义等[30]根据栉孔扇贝的性腺指数及组织学特征将栉孔扇贝的生殖周期划分为五个阶段: 休止期、增殖期、生长期、成熟期以及生殖期。在增殖期性腺中，生殖细胞将开始新一轮发生，该过程与性腺初始分化及发育阶段相类似，此时miR-375_1是否也会具有与幼贝雌雄分化时期相同的差异表达模式？雌雄差异表达的miR-375_1所调控的靶基因有哪些？靶基因又存在何种特定表达模式？针对这些问题，本研究以栉孔扇贝为主要研究材料，通过生物信息学分析预测获得miR-375_1的潜在靶基因; 在靶基因中筛选获得可能参与精子发生相关的基因，并通过双荧光素酶报告基因系统验证这些基因与miR-375_1的靶向关系; 同时，通过原位杂交实验，验证了有效靶基因bmi1 mRNA在栉孔扇贝精巢中的细胞学定位。本研究成果为揭示miR-375_1在栉孔扇贝性腺发育过程中的作用提供重要科研数据，并对加深贝类性腺发育调控机制的理解及进一步在贝类中进行育性控制具有重要的价值。
1 材料与方法 1.1 实验材料本实验以购自中国山东省青岛市台东南山海鲜市场的二龄栉孔扇贝(平均壳高为(6.28±0.52) cm)为材料。购买后于实验室条件下暂养2 d，然后挑取活力旺盛个体进行取样，其中不同发育时期的雌、雄个体各取样3只。称取其性腺质量及软体质量，并计算性腺指数(Gonadosomatic index，GSI; GSI=性腺质量/软体质量× 100%)[30]，将栉孔扇贝的性腺划分为4个发育时期: 增殖期(卵巢GSI=(4.93±0.60)%，精巢GSI=(4.88±0.26)%)，此时性腺滤泡中开始出现精母细胞及卵黄发生前期卵母细胞，并散布在滤泡壁上; 生长期(卵巢GSI=(7.21±0.68)%，精巢GSI=(8.98±0.32)%)，此时滤泡内精母和卵母细胞数量增加，各发育阶段生精和生卵细胞在生长期后期逐渐出现; 成熟期(卵巢GSI=(11.34±1.58)%，精巢GSI = (10.67±0.68)%)，此时滤泡腔内充满生殖细胞，滤泡中央存在大量成熟的卵和精子; 休止期(卵巢GSI=(3.46±0.47)%，精巢GSI=(3.49±0.84)%)，此时滤泡呈现明显的空腔状态，滤泡壁由单层滤泡细胞构成。
1.2 栉孔扇贝性腺总RNA提取采用酸性酚-氯仿抽提法提取栉孔扇贝性腺组织总RNA[31]，并通过紫外分光光度计法和1.2%琼脂糖凝胶电泳法检测RNA质量与浓度。RNA保存于-80 ℃条件下以备用。
1.3 栉孔扇贝性腺组织cDNA合成以及miRNA cDNA合成使用Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒(供应商: 湖南艾科瑞生物公司)来合成栉孔扇贝雄性性腺cDNA。同时，使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(供应商: 湖南艾科瑞生物公司)来合成栉孔扇贝增殖期精巢与卵巢的miRNA cDNA，为后续定量检测提供模板。
1.4 实时荧光定量PCR设计合成miR-375_1特异性引物，使用U6作为内参基因[9]，以miRNA cDNA为模板，通过RT-qPCR检测miR-375_1在栉孔扇贝增殖期的精巢与卵巢中的表达情况。实时荧光定量PCR引物如表 1所示。
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表 1 实时荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) |
使用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(供应商: 湖南艾科瑞生物公司)和Applied Biosystems 7500实时荧光定量PCR仪(品牌: Thermo)，并按照它们的操作说明书进行PCR扩增: 预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 3 s，退火60 ℃ 30 s，循环40次。每组设置3个生物学重复和3个技术重复。根据2－ΔΔCt法计算出miR-375_1在栉孔扇贝增殖期精巢与卵巢的相对表达量。
1.5 栉孔扇贝miR-375_1调控靶基因预测本课题组以往研究[7]获得的栉孔扇贝miR-375_1成熟体序列为5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUUA-3’，其种子序列为UUGUUCG。
从MolluscDB数据库(http://mgbase.qnlm.ac/home)中获取栉孔扇贝基因组及转录组数据[32]，利用RNAhybrid在线网站(http://bibiserv.techfak.unibielefeld.de/rnahybrid/)及miRanda在线网站(http://www.miranda.org/) 预测miR-375_1的靶基因。通过栉孔扇贝基因组注释信息和文献[2-3, 32-49]获得所预测靶基因的功能。筛选出miR-375_1的靶基因中与精子发生相关的基因后，在MolluscDB数据库中获取这些基因在栉孔扇贝成熟个体各个组织中表达的TPM值，并利用TBtools软件绘制成热图[50]。
1.6 双荧光素酶报告基因载体构建及突变载体构建根据基因的表达信息并结合已报道文献，选取bmi1、cfap45、dmrt1、tssk4-1和tssk4-2基因为研究对象，进一步探究其是否受到miR-375_1的调控。通过RNAhybrid在线软件(http://bibiserv.techfak.unibielefeld.de/rnahybrid/)获得靶基因与miR-375_1的结合序列，参数设置为hits per target=5，且energy threshold=-20，再结合序列上、下游第100—200对碱基处设计引物，用于构建双荧光素酶报告基因载体pmirGLO，引物序列如表 2所示。以栉孔扇贝成熟期精巢cDNA为模板，构建pmirGLO-bmi1、pmirGLO-cfap45、pmirGLO-dmrt1、pmirGLO-tssk4-1和pmirGLO-tssk4-2质粒。进一步，使用突变引物(见表 3)，通过Fast Mutagenesis System试剂盒(供应商: 北京全式金生物技术股份有限公司)构建pmirGLO-bmi1突变质粒。使用无内毒素质粒小提中量试剂盒(供应商: 天根生化科技(北京)有限公司)提取所构建质粒，经紫外分光光度计和1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，保存于－20 ℃条件下以备用。
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表 2 构建双荧光素酶报告基因载体引物 Table 2 Primers for construction of dual luciferase reporter gene vectors |
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表 3 pmirGLO-bmi1的突变载体引物 Table 3 Primers for mutation vectors construction of pmirGLO-bmi1 |
通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成miRNA模拟物miR-375_1-mimics后，使用Lipofectamine 2000转染试剂(品牌: Invitrogen)进行脂质体转染，在此过程中将miR-375_1-mimics及含有目的片段的双荧光素酶报告基因载体共转染至HEK293T细胞中，每组设置3个重复。转染后培养48 h，使用Dual-LuciferaseⓇ双萤光素酶报告基因检测系统(品牌: Promega)检测细胞中的荧光素酶活性。
1.8 原位杂交根据bmi1基因序列信息，设计原位杂交检测所需探针合成引物(见表 4)。以栉孔扇贝成熟期精巢cDNA为模板，PCR扩增来合成原位杂交探针模板，并使用Sp6/T7 RNA聚合酶(品牌: Thermo)体外转录合成地高辛标记bmi1基因原位杂交探针。
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表 4 bmi1基因原位杂交探针引物 Table 4 Primers for in situ hybridization of bmi1 gene |
根据本实验室已建立的栉孔扇贝组织切片原位杂交方法[32]，对栉孔扇贝精巢中bmi1基因的细胞学定位进行检测。
2 结果 2.1 miR-375_1在栉孔扇贝增殖期精巢与卵巢中的雌雄差异显著RT-qPCR结果显示(见图 1)，miR-375_1在栉孔扇贝性腺发育周期均具有雌雄显著差异(P < 0.05): 其在休止期和增殖期卵巢中高表达，且增殖期时差异最大，卵巢中的相对表达量约是精巢的95倍; 在生长期，miR-375_1在精巢中的表达量达到最高; 发育至成熟期，其表达量开始下降，降至生长期的59%。
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(数值为平均值±标准差，样本数n=3;设定miR-375_1在增殖期精巢中的表达量为1，其他发育时期性腺中的表达量以增殖期精巢的倍数表示; : P < 0.05，: P < 0.01，: P < 0.00 01。Values are expressed as Mean ± SD, sample number n=3. The relative levels of miR-375_1 in proliferative testis is set to 1, and the expression in gonads of other developmental periods is indicated as a multiple of it. : P < 0.05;: P < 0.01, : P < 0.00 01.) 图 1 miR-375_1在栉孔扇贝不同发育时期精巢和卵巢的相对表达量 Fig. 1 Relative expression of miR-375_1 in the testis and ovary of C. farreri |
通过RNAhybrid和miRanda在线网站分别预测到2 706和360个潜在的靶基因，两者共有158个基因存在交集(见图 2a)。进一步分析这些交集基因发现，共有10个基因与精子发生密切相关，具体信息如表 5所列。
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(a. RNAhybrid与miRanda两个在线网站预测到的miR-375_1靶基因。b. 10个与精子发生相关基因在各个组织中的表达热图。a. Target genes of miR-375_1 predicted by each of the two online websites RNAhybrid and miRanda. b. Expression heatmap of the 10 genes related to spermatogenesis in various tissues) 图 2 miR-375_1靶基因预测及精子发生相关靶基因基因的表达模式 Fig. 2 Target genes prediction of miR-375_1 and expression patterns of genes related to spermatogenesis |
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表 5 与精子发生相关的miR-375_1靶基因信息 Table 5 The information of ten miR-375_1 target gene related to spermatogenesis |
对这10个基因在栉孔扇贝各组织中的表达情况进行分析发现，除cfap45和dyh5外，其余8个基因均仅在雄性个体精巢中有最高的表达量(见图 2b)。
2.3 miR-375_1可以调控bmi1、cfap45、dmrt1和tssk4-1的表达综合基因研究现状及基因表达情况，选择bmi1、cfap45、dmrt1、tssk4-1和tssk4-2这5个基因作为研究对象，利用RNAhybrid在线网站预测这5个基因同miR-375_1的结合位点及结合的最小自由能(Minimum free energy，MFE)。结果显示，miR-375_1的种子序列同这5个基因均有结合位点，且它们的MFE都小于-24.3 kcal/mol(见图 3a)。
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(a. miR-375_1与靶基因结合位点的预测结果。斜体加粗碱基代表miR-375_1种子序列。b. miR-375_1与靶基因的双荧光素酶报告基因检测。将对照组的相对荧光强度设置为1，实验组的相对荧光强度表示为对照组的倍数; 所有结果均以平均值±标准差表示，样本数n=3;P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，ns表示无显著差异。a. Predicted results of miR-375_1 binding site to target genes. The bold italic bases represent the binding sequence of miR-375_1 to target genes. b. Dual luciferase activity assay of miR-375_1 and target gene. The relative fluorescence intensity of the control group is set to 1, and the relative fluorescence intensity of the experimental group is expressed as fold of the control group. Values are expressed as Mean ± SD, sample number n=3. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, ns indicates no significant difference.) 图 3 miR-375_1与靶基因结合位点的预测及双荧光素酶报告基因检测 Fig. 3 Binding site prediction and dual luciferase activity assay of miR-375_1 and target genes |
双荧光素报告基因实验结果证实，miR-375_1同bmi1、cfap45、dmrt1和tssk4-1基因都具有靶向调控关系。与对照组相比，这些基因相对荧光强度均显著下降(见图 3b)，而miR-375_1同tssk4-2基因不具备靶向关系，其相对荧光强度与对照组没有显著差异。其中，bmi1基因的相对荧光强度下降最为明显，与对照组相比降低了57.8%(P < 0.01)。
针对miR-375_1同bmi1基因的结合位点设计突变质粒(见图 4a)。进一步通过双荧光素酶报告基因实验证明，当该结合位点突变时，miR-375_1不再与bmi1基因结合，其相对荧光强度与对照组相比没有显著差异(见图 4b)。
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(a. 突变位点示意图。斜体加粗碱基序列代表miR-375_1种子序列，下划线代表突变位点。b. pmirGLO-bmi1突变体双荧光素酶活性检测结果。WT和MT分别表示未突变型和突变型; 将对照组的相对荧光强度设置为1，实验组的相对荧光强度表示为对照组的倍数; 所有结果均以平均值±标准差表示，样本数n=3;P < 0.01，ns表示无显著差异。a. Schematic diagram of the mutation site. The bold italic bases represent the binding sequence of miR-375_1 to bmi1, and the underlined bases represent the mutation site. b. Results of dual luciferase activity assay of pmirGLO-bmi1 vectors. WT and MT indicate unmutated and mutant types, respectively. The relative fluorescence intensity of the control group is set to 1, and the relative fluorescence intensity of the experimental group is expressed as fold of the control group. Values are expressed as Mean ± SD, sample number n=3. P < 0.01, ns indicates no significant difference.) 图 4 pmirGLO-bmi1突变载体的双荧光素酶报告基因检测 Fig. 4 Dual luciferase activity assay of the pmirGLO-bmi1 mutant vector |
为进一步了解与miR-375_1具有最强调控关系的bmi1在栉孔扇贝精巢中的表达情况，利用原位杂交技术对bmi1的mRNA细胞学定位进行探究。结果显示，在栉孔扇贝增殖期(见图 5a)和生长期(见图 5c和5d)精巢中均未检测到bmi1的表达; 而在成熟期精巢中，bmi1在精细胞和精子中呈现特异性的表达模式(见图 5e和5f)。
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(a.增殖期精巢; b.成熟期精巢阴性对照; c.生长期精巢; e.成熟期精巢。图d和f分别为图c和e中用黑色虚线框标出的局部放大图。Sg、Sc、St和Sz分别表示精原细胞、精母细胞、精细胞和精子。a. Proliferative stage; b. Negative control of mature stage; c. Growing stage; e. Mature stage. Figures d and f are the local amplification plots highlighted with black dashed boxes in figures c and e. Sg、Sc、St and Sz indicate spermatogonia, spermatocytes, spermatocytes and sperm, respectively.) 图 5 栉孔扇贝bmi1在精巢中的细胞学定位 Fig. 5 Cyto-localization of bmi1 in testes of C. farreri |
miRNA作为一种内源性调控因子，在基因表达调控方面的作用一直备受关注，其最早在线虫中被发现[51]，后经系统性研究，现已成为当下非常重要的一类非编码RNA，并延伸出被广泛应用于基因功能研究的RNAi技术。miRNA的作用机制在物种进化中十分保守，其具有组织与时空特异性，能精确调控基因的表达。如小鼠生殖细胞中，miR-10a过表达导致调控减数分裂的靶基因rad51表达下调，产生大量未分化精原细胞，导致雄性不育[19]。在合浦珠母贝(Pinctada fucata martensii)中，novel-miR-63的过表达可以降低同免疫和抗氧化相关酶的活性，在抵御炎症过程中发挥重要作用[9]。本课题组在以往研究工作中发现了一个在栉孔扇贝性别起始分化阶段雌性性腺中具有高表达的miR-375_1[7]，为了进一步探究其在栉孔扇贝性别发育和性腺功能中的作用，本研究继续对其作用机制进行了探讨。
定量检测结果显示，栉孔扇贝miR-375_1在雄性成贝休止期至增殖期的表达模式与其在幼贝起始性别分化阶段基本相同。具体来说，它在卵巢中的表达量较高，而在精巢中的表达量很低。在休止期至增殖期的过程中，栉孔扇贝性腺组织开始进行重新构建，滤泡中的性原细胞通过有丝分裂进行增殖，同时部分性原细胞开始进行减数分裂，形成性母细胞。因此，无论在栉孔扇贝幼贝的性别初始分化和发育阶段，还是在成贝性腺初始发育阶段，均存在生殖细胞的起始发育，并伴随性腺功能的逐渐完善，而在此期间miR-375_1始终具有显著的雌性高表达特征。在精子发生过程中，雄性生殖细胞会经历从精原细胞到精母细胞再到精子的转变过程，其中生精细胞的细胞核会发生变化，染色体高度凝缩并使得多数基因停止表达。而精子发生这一复杂过程需要关键基因在各个发育节点的精准调控，因此在生殖细胞中需要提前储存相应的mRNA，并通过特定的方式调控其适时表达[52-53]，非编码RNA正是一种可以特异性识别mRNA并调控其表达的工具。miRNA可以通过与目标mRNA在P体(P-bodies)中累积，进而阻止mRNA翻译，其中一些mRNA还可以从P体中退出并重新被翻译，以发挥相应功能[54-55]。因此，本研究认为，miR-375_1在栉孔扇贝增殖期精巢的低水平表达可能是为了在精子发生早期基因转录尚未停止前完成精子发生相关的基因mRNA的积累，以供生精细胞后续发育和分化所需，而在增殖期卵巢中具有较高的表达量可能是为了抑制同精子发生和精巢功能相关的基因，从而维持卵巢的正常发育。有研究发现，miR-375的表达水平在1和6月龄的军牧1号白猪的睾丸组织中的表达量有显著差异，其中6月龄睾丸组织中miR-375的表达量是1月龄的5.4倍[56]。栉孔扇贝性腺从增殖期向生长期发育过程中，miR-375_1的表达量显著提升，但发育至成熟期时其表达量又会有所降低，这种表达模式与已知报道相似，这提示其在配子发育和性腺功能维持中发挥重要的作用。
本研究进一步对miR-375_1的靶基因进行分析发现，其潜在靶基因中存在与精子发生相关的基因。例如，bmi1基因表达产物是Polycomb抑制复合物1(Polycomb repressor complex，PRC1)的组成部分，在小鼠中发现其通过抑制Wnt10b/β-catenin信号通路来促进精原干细胞维持[57]，而bmi1缺失则会通过减少睾酮合成、增加氧化应激以及DNA损伤等来抑制生殖细胞的增殖，使得雄性个体不育[34]。cfap45作为一种AMP结合蛋白，支持精子的鞭毛运动，当其功能丧失时会导致弱精症[37]。dmrt1 mRNA在栉孔扇贝精巢的所有阶段的生殖细胞中均存在，这暗示dmrt1可能在栉孔扇贝雄性个体中参与精巢维持的功能[32]。tssk4 mRNA则被报道在海湾扇贝(Argopecten irradians)精巢的精细胞和精子中表达，这暗示其可能在精子成熟过程中发挥作用[48]。为进一步了解这些靶基因是否受到miR-375_1的调控，本研究构建了靶基因双荧光素酶报告基因载体，并与miRNA模拟物共转染HEK293T，从而验证出miR-375_1同bmi1、cfap45、dmrt1和tssk4-1均具有调控关系。结合突变载体共转染结果发现，miR-375_1与bmi1之间的作用强度最高，这表明miR-375_1可以通过种子序列结合并调控bmi1基因的表达。
Zhang等[33]的实验结果显示，bmi1在小鼠未分化的精原细胞中表达，而Dai等[34]实验结果则表明bmi1在小鼠的几乎所有类型的雄性生殖细胞中均有表达。本研究通过原位杂交实验确定了bmi1在栉孔扇贝精巢中的细胞学定位，发现bmi1的mRNA仅在精子发生的后期于精细胞和精子中表达，这表明bmi1在栉孔扇贝中可能主要参与精子的成熟与形成过程，这与其在小鼠中的研究结果存在差异，进一步说明该基因在不同物种中的作用不尽相同。结合miR-375_1在栉孔扇贝成熟期精巢中的表达量可以推测，当精巢发育到成熟期时，miR-375_1的表达下降是为解除对同精子成熟相关的基因(如bmil1和tssk4)的抑制，从而允许这些基因发挥相应功能。
4 结语本文揭示了miR-375_1在栉孔扇贝各发育时期性腺中的表达模式，并通过分析验证表明，miR-375_1可以通过调控与精子发生相关的基因(如bmi1)，参与调控栉孔扇贝性腺发育和精子发生的过程。这些研究结果丰富了贝类miRNAs参与生物学过程调控的理论体系，为进一步解析贝类配子发生机制提供重要的科学数据。未来，还需要通过过表达和敲降实验，更全面地理解miR-375_1的表达调控网络，以完善贝类性腺发育和配子发生的表达调控机制。
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1. Key Laboratory of Tropical Aquatic Germplasm of Hainan Province, Sanya Oceanographic Institution, Ocean University of China, Sanya 572025, China