2025, Vol. 55
2. 中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所，山东 青岛 266003;
3. 中国海洋大学海洋生物多样性与进化教育部重点实验室，山东 青岛 266003
像陆地农作物一样，经济养殖海带(Saccharina japonica)也会遭受各种各样细菌性病害的威胁。研究表明，海带的致病菌多为条件致病菌[1-3]。条件致病菌是指存在于健康藻体，当外界环境扰动或者宿主自身免疫受到破坏时而转变为致病菌，从而导致海藻宿主病害爆发的一类细菌[4-8]。中国学者普遍认为褐藻酸降解菌是海带病害的条件致病菌[9-11]。正常情况下，褐藻酸降解菌存在于健康海带藻体，但当养殖环境发生变化时，如光照强度增加或温度升高时，这些褐藻酸降解菌转变为致病菌[7, 12-13]。大部分褐藻酸降解菌属于假单胞菌属[1]、弧菌属[14]、盐单胞菌属[2]和交替单胞菌属[12]等。近期，Yang等[15]鉴定了一株海带条件致病菌——铜绿假单胞菌MSLj6-25(Pseudomonas aeruginosa MSLj6-25)。当MSLj6-25侵染海带后可引起绿烂的病症，显微观察结果显示，海带色素体明显聚集在细胞壁周围。
海藻表面除了存在条件致病菌，也存在对海藻致病菌具有拮抗作用的拮抗菌[16-17]或可使宿主免受致病菌侵害的有益菌[18-19]。Buck等[20]首次从多种大型海藻石莼(Ulva sp.)、蕨藻(Caulerpa sp.)、Dictyota sp.、Dasya sp.和纵胞藻(Centroceras sp.)藻体表面分离出对人类致病菌(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)、大肠杆菌(Escherichia coli)、白色念珠菌(Candida albicans)等)具有拮抗活性的15株菌。Rao等[21]从石莼(Ulva lactuca)表面分离出的长衫假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tunicata)可产生一种抗菌蛋白(Antibacterial protein)AlpP，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有效的抑菌活性。从红叶藻(Delesseria sanguinea)分离的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)和婴儿芽孢杆菌(Bacillus infantis)对海藻致病菌-叶氏假交替单胞菌ATCC 700519T(Pseudoalteromonas elyakovii ATCC 700519T)和溶菌栖藻菌ATCC 700679(Algicola bacteriolytica ATCC 700679)具有拮抗活性，且其次级代谢产物也可抑制致病菌的生长，说明海藻附生细菌可产生抗菌代谢物，有助于保护海藻免受致病菌的侵害[22]。近期，在野生及养殖海藻附生细菌群落中发现了有益菌。来自健康野生红藻Delisea pulchra藻体的暗棕色杆菌BS52(Phaeobacter sp. BS52, psBS52)可拮抗多种使D. pulchra得白化病的致病菌，且psBS52可通过缓解D. pulchra附生细菌群落的失衡, 以降低白化病的发生[18]。分离自养殖海带的溶藻弧菌X-2(Vibrio alginolyticus X-2, VaX-2)对海带白化病致病菌——杀鱼假交替单胞菌X-8(Pseudoalteromonas piscicida X-8, PpX-8)具有拮抗活性[19]。VaX-2可通过维持海带附生细菌群落稳定、调节海带中同免疫与应激保护相关基因的表达以及增加甜菜碱的分泌量来降低海带白化病的发病率，说明VaX-2是养殖海带的有益菌[19]。
基于传统微生物分离培养技术在分离纯化海藻附生细菌方面的应用，对于研究海藻附生细菌的生长特性、代谢机制、生理特征和生态功能等特性至关重要[23]。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，越来越多的海藻附生细菌被检测到，但依靠传统的微生物分离培养方法，仅能够分离培养0.001% ~ 0.100%的海藻附生细菌[23-24]。为克服这一限制，研究人员们致力于设计并改良培养基，以期分离纯化更多种类的海藻附生细菌。例如，Vairappan等[25]使用3种改良培养基成功分离并培养了健康和有白化病的日本皱海带(Laminaria religiosa)附生细菌，进而发现添加海藻酸钠的培养基分离细菌的多样性最高，具体菌种有Alcaligenes aquamarinas、交替单胞菌(Alteromonas sp.)、敏捷固氮单胞菌(Azomonas agilis)、拜氏固氮菌(Azotobacter beijerinckii)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、需盐小杆菌(Halobacterium sp.)、盐球菌(Halococcus sp.)和解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。随后通过侵染实验发现，交替单胞菌(Alteromonas sp.)是日本皱海带白化病的致病菌。此外，王韬洁[26]综合利用不同营养程度的培养基，分离了774株隶属于多个门类(变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、浮霉菌门和疣微菌门)的海带附生细菌，且这些结果涵盖了16S rDNA高通量测序检测到的所有门类。
海带是一种重要的世界性经济养殖海藻[7]。鉴于海带附生细菌对海带正常发育和健康的重要性，有必要运用改良培养基分离、鉴定海带附生细菌，并进一步筛选海带条件致病菌及拮抗菌。本研究中: 首先运用16S rDNA全长扩增子测序技术分析海带附生细菌群落的组成; 其次，为获得更多种类的海带附生细菌分离菌株，设计了4种改良培养基(1/10 ZoBell 2216E、添加褐藻胶的1/10 ZoBell 2216E、添加海带浸出液的1/10 ZoBell 2216E和海带浸出液培养基)，同时我们还使用了1种传统培养基(ZoBell 2216E)作为对照，通过这5种培养基分离纯化海带附生细菌，并结合16S rDNA全长测序比对，完成了分离菌株的分类学鉴定; 最后，运用海带-致病菌侵染体系和抑菌实验，筛选海带条件致病菌和拮抗菌。本研究首次将16S rDNA全长扩增子技术与传统微生物分离培养方法相结合，对海带附生细菌群落的组成进行了深入探究。这一创新性的研究方法不仅丰富了我们对海带附生细菌的认识，也为后续的相关研究提供了有益的参考与借鉴。综上所述，本研究不仅在海带附生细菌的分离、鉴定与筛选方面取得了显著的成果，同时也为探究致病菌的致病机理以及应用有益菌防控海带病害的发生奠定了重要的前期工作基础。
1 材料与方法 1.1 海带附生细菌样品的采集2022年6月26日，自中国山东省荣成市威海长青海洋科技有限公司海带育苗场(37°19′41″N, 122°17′21″E)采集了健康的海带成熟孢子体样品。使用6根无菌棉签擦拭距生长点三分之一处50 cm2的海带成熟孢子体表面，以收集附生细菌。随后，将这6根棉签放置于10 mL无菌离心管中，从而收集了6个附生细菌样品(6个装有6根富集海带附生细菌棉签的离心管)，并在低温避光条件下4 h内运抵实验室。其中，3个样品用于16S rDNA全长扩增子测序，3个样品用于附生细菌的分离培养。
1.2 16S rDNA全长扩增子测序 1.2.1 DNA提取、扩增和测序使用HiPure Soil DNA提取试剂盒(品牌: Magen)分别提取3个样品海带附生细菌的基因组DNA。通过PCR技术扩增16S rDNA的V1—V9区域，扩增程序如下: 95 ℃ 2 min，1个循环; 95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35个循环; 72 ℃10 min，1个循环。引物为27F(AGRGTTYGATYMTGGCTCAG)和1492R(RGYTACCTTGTTACGACTT)。反应体系如下: 高保真PCR混合物(品牌: TransGen Biotech)25 μL，引物27F和引物1492R(10 μmol/L)各1 μL，基因组DNA 5 ng，以及用以补充至50 μL的ddH2O。使用DNA凝胶提取试剂盒(品牌: Axygen Biosciences)纯化PCR扩增产物。运用ABI StepOnePlusTM PCR系统(品牌: Life Technologies)进行PCR产物的定量。使用SMRTbellTM Template Prep Kit(品牌: PacBio)构建测序文库，并运用Qubit 3.0荧光测量仪和FEMTO Pulse系统(品牌: Agilent Technologies)进行质量评估。将符合质量要求的测序文库上传至PacBio Sequel平台进行测序。原始测序数据已上传NCBI SRA(Sequence Read Archive)数据库(序列号: PRJNA1078154)。
1.2.2 数据处理使用SMRT Link软件将原始序列文件校正转化为环状一致性序列(Circulular consensus sequencing，CCS)，默认校正参数minfullpass=3且minPredictedAccuacy=99。使用Cutadapt软件删除CCS reads的引物序列，对剩余的CCS reads进行质量过滤和长度过滤，去除连续相同碱基数大于8的低质量reads，并保留长度为1.3~1.7 kb的reads，得到高质量的Clean reads。将Clean reads以相似度不小于97%聚类为OTUs(Operational taxonomic units)，并基于UCHIME算法去除嵌合体。使用NCBI 16S rDNA数据库(202101版)中Blast工具(2.6.0+版)进行物种比对注释，保留best hit中E-value < 1 × 10-5、比对覆盖不小于60%且序列相似度不小于70%的比对结果。在此基础上，去除未知来源序列。
1.2.3 物种组成分析使用Krona软件(2.6版)分析海带附生细菌群落中每个分类物种的相对丰度，并利用R语言ggplot2软件包(2.2.1版)绘制物种组成堆叠图。
1.3 海带附生细菌的分离纯化为提高分离菌株的多样性，本文选择5种培养基，包括一种传统培养基(M1)和4种改良培养基(M2、M3、M4与M5，见表 1)。M1为ZoBell 2216E培养基，M2为1/10 ZoBell 2216E培养基，M3为添加褐藻酸的1/10 ZoBell 2216E培养基，M4为添加海带浸出液的1/10 ZoBell 2216E培养基，M5为海带浸出液培养基，各培养基配方详情见表 1。
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表 1 5种培养基的配方 Table 1 Composition of five culture media |
向3个装有富集细菌棉签的离心管中分别加入5 mL无菌海水，涡轮震荡3 min，收集菌悬液。运用10倍稀释法，取不同稀释浓度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6)的菌悬液80 μL，均匀涂布于5种培养基上，每个稀释浓度设置3次重复实验。培养基置于25 ℃光照培养箱(型号: GXZ-280B;供应商: 宁波市科技园区新江南仪器有限公司，中国)中培养4周。根据菌落形态特征，如形状、颜色和光泽等，挑选不同形态特征的单菌落以通过划线进行纯化。每个菌株最少纯化3次。纯化后将菌株接种于液体培养基中，25 ℃、120 r/min条件下培养至菌液OD600 ≈ 1.0，随后将菌液与60%(v/v)甘油以1∶1比例混合，并保存于-80 ℃冰箱以备用。
1.4 分离菌株的分子鉴定 1.4.1 16S rDNA序列扩增与测序使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(型号: B518255-0050;供应商: 生工生物工程(上海)股份有限公司)提取分离菌株的总DNA，然后以该总DNA为模板扩增16S rDNA序列。采用通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)来扩增16S rDNA的V1—V9区域。PCR反应体系配置如下: Taq PCR Master Mix 12.5 μL，引物27F和1492R (10 μmol/L)各1 μL，DNA模板(1~10 μg/mL)2 μL，以及ddH2O 8.5 μL。PCR扩增程序设置如下: 94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环; 72 ℃延伸10 min。PCR产物经凝胶电泳检测与目的序列条带片段大小一致后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司青岛分公司进行基因测序。
1.4.2 构建系统发育树测序结果经双端拼接后得到完整的16S rDNA的V1—V9区域序列，将菌株的16S rDNA全长序列与EziBioCloud基因数据库进行比对，获得相关标准菌株的信息。运用MEGA-X软件构建系统进化树，并使用该软件中ClustalW算法进行序列比对，采用Neighbour-join法构建系统进化树。条件致病菌和拮抗菌的16S rDNA序列已上传至NCBI数据库(登录号: PP347739—PP347757)。
1.5 序列比对使用Blast序列局部比对在线工具(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/blastcmp)比对分离菌株的16S rDNA序列与16S rDNA全长扩增子测序中的操作分类单元(Operational taxonomic units，OTU)序列。经比对后得到序列相似度，并将序列相似度为100.0%的菌株定义为与OTU相匹配的分离菌株。
1.6 海带条件致病菌的筛选 1.6.1 菌株活化取-80 ℃冰箱保存的0.5 mL菌液，接种于5 mL相应的液体培养基。然后，将培养基置于摇床中，以120 r/min的速度在25 ℃下培养，直至OD600 ≈ 0.5。活化3次，以保证菌株恢复活力。
1.6.2 侵染实验2022年11月14日，自中国山东省威海长青海洋科技有限公司养殖区采集健康的海带幼孢子体(大约20~37 cm)。样品在低温避光、(10±0.5) ℃条件下4 h内运送至实验室后，立即使用无菌海水冲洗3次，以去除有损伤和白化的样品; 将处理后的海带幼孢子体置于GXZ-280B光照培养箱(光周期为12 h光∶12 h暗)中暂养过夜，每天更换灭菌的海水。
使用无菌手术刀沿海带幼孢子体样品两侧切割成1.0 cm×1.0 cm的组织块。将组织块随机地放入24孔培养板(品牌: LABSELECT)中。每个培养孔放入1块组织块。向每个培养孔中加入1 mL活化的分离菌株菌液(OD600 ≈ 0.5)作为侵染组，而对照组则加入1 mL菌株分离时使用的固体培养基(M1、M2、M3、M4和M5)对应的液体培养基。将24孔培养板置于温度为(10 ± 1) ℃、光周期为12 h光∶12 h暗的光照培养箱中培养24 h。分别在0、6和24 h观察海带组织块的变化，并使用光学显微镜(型号: ECLIPSE Ni-U; 品牌: Nikon)拍照记录。每个分离菌株设置12个重复实验。
1.7 拮抗菌的筛选 1.7.1 分离菌株的OD600-菌落形成单位(CFU)相关性曲线绘制参照李亭玉等[27]的方法，进行以下操作以绘制OD600与CFU之间的相关性曲线: 将分离菌株接种于ZoBell 2216 E液体培养基中，于25 ℃、120 r/min条件下过夜培养，获得分离菌株菌液(OD600 ≈ 0.5);取分离菌株菌液进行10倍梯度稀释，为便于计数，取少量(60 μL)不同稀释浓度(10-3、10-4、10-5、10-6和10-7)的菌液均匀涂布于ZoBell 2216E固体培养基上，于25 ℃培养箱中培养2 d，计算分离菌株的CFU; 取分离菌株菌液进行2、4、6和8倍稀释，测量OD600值; 以OD600值为X轴、CFU值为Y轴，绘制分离菌株的OD600-CFU相关性曲线。
1.7.2 抑菌实验运用伯克霍尔德琼脂扩散法，以海带白化病致病菌PpX-8为目标菌株，筛选分离菌株中能够抑制PpX-8生长的拮抗菌。具体步骤如下: (1)配制琼脂含量为0.6%(w/v)的半固体ZoBell 2216E培养基; (2)灭菌后冷却至室温，加入1%(v/v)PpX-8菌液(1.0 × 108 CFU/mL)，充分混匀后倒入培养皿中; (3)将直径6 mm的无菌圆形滤纸放置于半固体培养基的中央，并在每个滤纸上滴加6 μL分离菌株的菌液(5.0 × 108 CFU/mL); (4)于25 ℃培养箱中培养2周(每个分离菌株设置6个重复); (5)2周后，观察并记录分离菌株在半固体培养基中的抑菌圈大小。将抑菌圈直径不小于7.0 mm的分离菌株定义为抑制PpX-8生长的拮抗菌。
2 结果 2.1 16S rDNA全长扩增子测序的海带附生细菌群落组成运用全长16S rDNA全长扩增子测序技术，经质量过滤和去除未知序列后，共获得623个OTUs。这些OTUs归属于15个门、33个纲、73个目、134个科、279个属和320个种。在门水平上，海带附生细菌群落的优势菌门(相对丰度不小于10.0%)为变形菌门(Proteobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)，两者相对丰度分别为48.7%和39.2%，合计占细菌群落总数的87.9%(见图 1)。在种水平上，海带附生细菌群落的优势菌种(相对丰度不小于10.0%)为居墨角藻海芽菌(Mariniblastus fucicola)、类球形颗粒球菌(Granulosicoccus coccoides)和刚毛藻沙滩单胞菌(Litorimonas cladophorae)，这3种菌相对丰度分别为35.0%、12.0%和11.6%，共占细菌群落总数的58.6%(见图 1)。
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(图A和B分别展示了门水平和种水平海带附生细菌群落的组成。Panel A and B show the epiphytic bacterial communities composition of S. japonica at phylum levels and species levels, respectively.) 图 1 16S rDNA全长扩增子测序分析的海带附生细菌群落的组成 Fig. 1 Epiphytic bacterial communities composition of S. japonica by full-length 16S rDNA amplicon sequencing analysis |
使用传统培养基(ZoBell 2216E培养基，M1)和4种改良培养基(M2、M3、M4与M5)，共分离出195株菌株(见表 1)。经分子鉴定，这些菌株归属于4个门、5个纲、11个目、14个科、20个属和25个种。在门水平上，分离菌株的优势菌门(相对丰度大于10.0%)有假单胞菌门(Pseudomonadota)、厚壁菌门(Bacillota)和放线菌门(Actinomycetota)，它们的平均相对丰度分别为46.7%、42.1%和10.8%(见图 2A)。在属水平上，分离菌株的优势菌属(相对丰度大于10.0%)有科贝特氏菌属(Cobetia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和副芽孢杆菌属(Metabacillus)，它们的平均相对丰度分别为40.0%、16.4%和11.8%(见图 2B)。其中，Cobetia、Bacillus和Metabacillus各包括2个种。在种水平上，分离菌株中的优势菌种(相对丰度大于10.0%)有海绵科贝特氏菌(Cobetia amphilecti)和高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，二者的平均相对丰度分别为38.9%和18.6%(见图 2C)。
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(A—C图分别为门、属及种水平分离菌株的组成，其中“其他”表示分离菌株数仅有1和2株的菌属和菌种; D: 利用不同培养基分离纯化的细菌种水平韦恩图; E: 利用不同培养基分离获得的细菌种水平的组成。Panels A—C show the composition of isolated bacterial strains at phylum, genus and species level, respectively; "Other" represents isolated bacterial genera and species with only 1 and 2 isolates; D: Venn diagram of community composition of isolated bacteria using different culture media; E: The community composition of isolated bacteria using different culture media.) 图 2 传统微生物分离培养方法分离鉴定的菌株组成 Fig. 2 Composition of isolated bacterial strains of S. japonica by traditional microbial isolation and culture method |
在种水平上，利用5种培养基分离纯化的细菌多样性由高到低依次为M2(14种)、M3(11种)、M4(9种)、M1(5种)和M5(5种)(见表 2)。除M5(海带浸出液培养基)外，利用每种培养基均可分离出特有的细菌(见图 2D)。其中，利用M1(ZoBell 2216E培养基)分离得到的特有菌种为坐皮肤球菌(Kytococcus sedentarius); 利用M2(1/10 ZoBell 2216E培养基)分离得到的特有菌种数最多，为7种菌，分别是印度冻原迪茨氏菌(Dietzia kunjamensis)、海考克氏菌(Kocuria marina)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)、咸海鲜属间芽孢杆菌(Mesobacillus jeotgali)、裙带菜颗粒球菌(Granulosicoccus undariae)、乌汶伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ubonensis)和Kocuria assamensis; 利用M3(添加褐藻胶的1/10 ZoBell 2216E培养基)分离得到特有菌种为印度副芽孢杆菌(Metabacillus indicus)、卡塞雷斯氏纯洁杆菌(Modestobacter caceresii)、马尿气球菌(Aerococcus urinaeequi)、海洋科贝特氏菌(Cobetia marina)和食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans); 利用M4(添加海带浸出液的1/10 ZoBell 2216E培养基)分离得到的特有菌种为墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)、放射杆状土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)和Bacillus zanthoxyli(见图 2E)。这些研究结果表明，使用改良培养基M2—M4均可增加分离菌株的种类。
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表 2 不同培养基分离的细菌数量 Table 2 Number of the isolated strains of different culture media |
在这195株分离菌株中，有27株的16S rDNA序列与自身最近邻标准菌株的16S rDNA序列相似度低于98.65%，为潜在新种。由表 2可以看出，分离潜在新种率最高的培养基为改良培养基M2和M3。
2.3 条件致病菌的筛选通过侵染实验，共筛选出11株24 h内在实验室条件下导致海带组织块绿烂病症发生的条件致病菌。其中，传统培养基M1分离纯化的条件致病菌数量最多(见表 2)。
根据绿烂病症发生的时间，将6 h内导致海带绿烂病症发生的菌株定义为强条件致病菌，共筛选出7株强条件致病菌。分子鉴定结果显示，7株强条件致病菌为海绵科贝特氏菌e-18(Cobetia amphilecti e-18)、高地芽孢杆菌e-37(Bacillus altitudinis e-37)、海绵科贝特氏菌b-18(Cobetia amphilecti b-18)、海洋科贝特氏菌b-39(Cobetia marina b-39)、高地芽孢杆菌c-4(Bacillus altitudinis c-4)、乳酪短杆菌c-12(Brevibacterium casei c-12)和海绵科贝特氏菌d-38(Cobetia amphilecti d-38)。显微观察显示，与对照组相比(见图 3A)，强条件致病菌侵染6 h时，海带组织出现明显变绿现象，色素体聚集在细胞壁周围(见图 3B); 侵染24 h时，海带组织变绿现象加剧(见图 3C)。
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(A: 对照组显微图; B: 条件致病菌马尿气球菌b-37侵染海带组织块的显微图; C: 强条件致病菌海绵科贝特氏菌e-18侵染海带组织块的显微图。标尺=20 μm.A: Microscopic images of control group; B: Microscopic images of tissue pieces of S. japonica infected by the opportunistic pathogenic bacteria A. urinaeequi b-37; C: Microscopic images of tissue pieces of S. japonica infected by the strongly opportunistic pathogenic bacteria C. amphilecti e-18. Bars=20 μm.) 图 3 条件致病菌诱导海带组织绿烂病症的显微图片 Fig. 3 Microscopic images of green-rotten diseased S. japonica tissues infected by the opportunistic pathogenic bacteria |
运用伯克霍尔德琼脂扩散法，共筛选8株对海带白化病致病菌PpX-8具有拮抗作用的菌株。其中，有5株属于芽孢杆菌属，2株属于科贝特氏菌属，1株属于罗塞略莫拉氏菌属。抑菌圈直径不小于20.0 mm的4株拮抗菌分别是高地芽孢杆菌b-17(B. altitudinis b-17)、高地芽孢杆菌c-30(B. altitudinis c-30)、高地芽孢杆菌e-8(B. altitudinis e-8)和罗塞略莫拉氏菌e-48(Rossellomorea sp. e-48)(见图 4)。高地芽孢杆菌b-17对PpX-8的抑菌活性最强，抑制圈直径不小于30 mm(见图 4)。
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(A: 拮抗菌的抑菌圈示例; B: 拮抗菌的抑菌圈直径。B图中的直径用平均直径±标准误差表示，样本数n = 6，不同字母之间表示有显著性差异(p < 0.05)。A: Example of growth inhibition zone of antagonistic bacteria; B: The zone of growth inhibition for antagonistic bacterial strains。Diameters in panel B are expressed as the mean diameter±standard error, sample number n=6, statistical differences (p < 0.05) are shown by different lowercase letters.) 图 4 拮抗菌对杀鱼假交替单胞菌X-8的拮抗活性 Fig. 4 Antagonistic activities of antagonistic bacteria against Pseudoalteromonas piscicida X-8 |
对195株分离菌株的16S rDNA序列与16S rDNA全长扩增子测序中的623个OTUs序列进行比对，结果显示，共有19株分离菌株与2个OTUs完全匹配(序列相似度为100.0%)，且这2个OTUs的相对丰度为0.013 4%和0.001 7%(见表 3)。其中，有2株分离菌株(C. amphilecti e-18和C. amphilecti e-46)为条件致病菌，且与OTU000169相匹配(见图 5)。
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表 3 与16S rDNA全长扩增子测序获得的OTUs序列相匹配的分离菌株 Table 3 Bacterial isolates corresponding to OTUs sequences by full-length 16S rDNA amplicon sequencing |
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(菌株名称后面括号内的序号为序列编号; 分支点上的数字为重复1 000次的自展值; 标尺0.01为核苷酸替换率。P. concharum VP3-02为外群。Accession numbers were listed behind strain numbers in parentheses; numbers at nodes indicate percentage levels of bootstrap support based on a Neighbor-joining analysis of 1 000 resampled datasets; Bar=0.01, substitutions per nucleotide position. P. concharum VP3-02 was used as an outgroup.) 图 5 基于条件致病菌和拮抗菌的16S rDNA序列构建的系统进化树 Fig. 5 Neighbor-joining trees based on 16S rDNA sequences showing the phylogenetic of opportunistic pathogenic bacteria and antagonistic bacteria |
海洋环境中存在数量庞大的微生物，但其可利用的营养物质极度匮乏。海洋微生物多数处于“寡营养”的环境[28]。传统的ZoBell 2216E培养基为富含营养的培养基，当寡营养微生物置于富营养的培养基上，微生物会产生大量自身难以降解的毒性氧物质(如过氧化氢、超氧化物等)，这些毒性氧物质的积累会造成微生物内膜受损，进而导致微生物的死亡[29-30]。Zengler等[31]通过稀释培养基浓度(以降低分离培养基中营养物质的含量)发现，寡营养的培养基可促进非可培养细菌的生长，从而提高分离菌株的多样性。代先祝等[32]同样证明稀释的LB培养基可获得多样性更高的分离菌株。本研究使用的改良培养基M2(1/10 ZoBell 2216E培养基)作为寡营养培养基，分离的菌株数量和种类均最高，说明使用寡营养培养基也可提高海带分离菌株的多样性。
M3(添加褐藻酸钠的1/10 ZoBell 2216E培养基)可有效富集海带条件致病菌。中国学者一致认为健康海带的藻体中存在条件致病菌——褐藻酸降解菌[7, 9-11]。褐藻酸降解菌能够分泌褐藻酸酶，可降解海带细胞壁的主要成分褐藻酸，导致原生质体的分离，褐藻酸酶的酶解作用是海带病烂的根本原因[33]。王艳玲等[34]通过使用褐藻酸钠为唯一碳源的安藤芳明选择性培养基，从病烂海带表面分离出8株褐藻酸降解菌，并通过侵染实验证实这8株褐藻酸降解菌均可导致健康藻体发生病症，表明它们是海带的致病菌，这一结果与本实验结果一致，说明向培养基中添加褐藻酸钠有利于海带条件致病菌的分离培养。
结合侵染实验和分子鉴定结果，本研究筛选到的6株条件致病菌被鉴定为海绵科贝特氏菌，1株被鉴定为海洋科贝特氏菌。科贝特氏菌隶属于变形菌门(Proteobacteria)盐单胞菌科(Halomonadaceae)，是一种广泛分布于海洋中的革兰氏阴性菌，分离自海洋沉积物、无脊椎动物和各种海鲜产品[35]。黄林彬等[36]发现，接种海洋科贝特氏菌后，野生坛紫菜和条斑紫菜产生红烂病症，显微观察发现，坛紫菜和条斑紫菜组织中出现铁锈红色的死亡细胞。蔡玲[37]也证实，海洋科贝特氏菌是海带绿烂病的条件致病菌。目前未见海绵科贝特氏菌有致病性的相关报道。本文首次筛选出6株可导致海带绿烂病症的海绵科贝特氏菌株，未来可进一步研究其致病机制。
16S rDNA全长扩增子测序数据分析显示，海带附生细菌群落的优势菌种有居墨角藻海芽菌、类球形颗粒球菌和刚毛藻沙滩单胞菌，三种菌相对丰度分别为35.0%、12.0%和11.6%，但使用本研究中的所有改良培养基均未分离纯化出上述3种细菌，说明本研究的改良培养基(使用寡营养培养基、培养基中添加褐藻酸钠和海带浸出液)并不适合分离海带附生细菌群落的优势菌种(居墨角藻海芽菌、类球形颗粒球菌和刚毛藻沙滩单胞菌)。居墨角藻海芽菌和刚毛藻沙滩单胞菌分别从褐藻和绿藻中被分离得到[38-39]。类球形颗粒球菌仅从海草表面被分离得到[40]，但本研究中并未从海带表面分离出同属菌种裙带菜颗粒球菌。研究表明，颗粒球菌属广泛存在于多种海带藻体表面(如极地海带和糖海带)[41-43]。结合本研究结果，在海带附生细菌群落中，居墨角藻海芽菌、类球形颗粒球菌(属于颗粒球菌属)及刚毛藻沙滩单胞菌的相对丰度均大于10%，推测这些菌种可能对海带的健康及附生细菌群落的稳定具有重要作用。未来可尝试分析这3株优势菌的基因组的代谢途径，根据其代谢物设计适合分离的改良培养基。以往研究表明，人类惠普尔病致病菌——惠氏营养不良菌(Tropheryma whipplei)极难培养，但Renesto等[44]通过分析其基因组的序列发现，惠氏营养不良菌缺乏9种氨基酸(组氨酸、色氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺)合成的代谢通路，这表明惠氏营养不良菌需要从外部环境中获取这9种氨基酸。基于此，本文作者设计了一种包含9种氨基酸的培养基，并成功从患有惠普尔病的患者的心脏瓣膜样品中分离到3株惠氏营养不良菌株。因此，通过分析居墨角藻海芽菌、类球形颗粒球菌及刚毛藻沙滩单胞菌基因组代谢途径而设计的改良培养基，有望成功分离培养出这些优势菌种。
本文筛选出8株对海带白化病致病菌PpX-8生长有抑制作用的拮抗菌。其中，5株拮抗菌均被鉴定为高地芽孢杆菌。芽孢杆菌在自然界分布极其广泛，常见于各种土壤、水域、食物和临床样本中[45-46]。芽孢杆菌在植物生态系统中扮演多样化的生态角色，尤其在促进植物生长和防控植物病害方面表现突出。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)是茶树根际微生物的优势菌种，具有抗真菌活性，能够抑制茶树根际微生物中的致病真菌的生长[47]。高地芽孢杆菌能够协助鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)吸收锌元素，从而促进鹰嘴豆植株生长[48]。Lu等[49]发现高地芽孢杆菌通过产生活性氧和促进胼胝质沉积可诱导大豆植株的抗病反应，从而显著降低致病菌Thanatephorus cucumeris引起的根腐病的发病率。除此之外，高地芽孢杆菌能够分泌一种混合脂肽，具有显著的抗真菌活性，能抑制致病真菌胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的生长[50]。因此，本研究获得的5株拮抗菌B. altitudinis b-17、c-30、e-8、a-12和e-12有望作为一种新型生物防治剂，用以预防海带病害的发生。值得注意的是，本研究中筛选到的条件致病菌(高地芽孢杆菌c-4和e-37)与拮抗菌株(高地芽孢杆菌b-17、c-30、e-8、a-12和e-12)均属于高地芽孢杆菌，这表明同一种菌的不同菌株可能发挥着不同的作用，这一现象与实验室前期研究结果一致[37, 51]。
4 结语本研究运用4种改良培养基分离鉴定的优势菌种与16S rDNA全长扩增子测序方法获得的优势菌种具有显著性差异，但未能分离获得高通量测序分析的优势菌种。其中，1/10 ZoBell 2216E改良培养基获得的分离菌株多样性最高，可作为未来分离海带附生细菌的推荐培养基。运用本研究设计的4种改良培养基，分离鉴定了科贝特氏菌占优势的条件致病菌以及以芽孢杆菌为主的海带白化病致病菌的拮抗菌。未来可尝试基于16S rDNA全长扩增子测序方法获得的优势菌——居墨角藻海芽菌、类球形颗粒球菌及刚毛藻沙滩单胞菌的基因组组学分析数据，并根据它们的代谢途径特点，设计改良培养基，以期分离培养出海带附生细菌群落中的优势菌种。
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