2025, Vol. 55
由于人口增长和渔获产量下降，水产养殖在全球粮食供应中所扮演的角色越发重要。预计到2030年，水产养殖产量将占全世界食用鱼类供应量的62%[1]。随着水产养殖业的蓬勃发展，水产养殖所需的饵料量也将相应增加。而生鲜饵料存在受限于季节、质量不稳定、存在易带入病原菌等问题。使用质量稳定、容易保存且营养均衡的水产配合饲料是养殖生物营养安全极为重要的课题[2]。
蛋白质对于鱼类非常重要，功能包括但不限于形成各类酶、激素和抗体，同时对于肉食鱼类也是重要的能量来源[3]。一般来说蛋白源也是水产配合饲料中成本占比最高的原料。而合理的糖脂比能提高蛋白质节约效率，通过糖异生，糖和脂可以在鱼类组织中相互转化并储存[4]。碳水化合物作为水产配合饲料中最为经济的功能物质可以有效降低成本支出，过往研究表明，适量添加的碳水化合物可以降低鱼类分解蛋白质产能[5-6]，文献[7-9]发现，饲料中碳水化合物占比达16% 可以提高大菱鲆饲料利用率和生长性能，而超过20% 则抑制生长并导致葡萄糖代谢紊乱。脂质是鱼类饲料中必需的营养素之一，脂肪在水产配合饲料中的作用主要是提供鱼类生长必需的脂肪酸并提供完整磷脂和胆固醇的来源，以用于线粒体中进行β氧化供能或是用于生物成长如合成激素和细胞膜成分等。在部分海水冷水鱼的配合饲料配方设计中被作为主要供能营养素添加[10]，但含量过高会影响鱼类生长或引起疾病[11-13]。若糖脂比不合适则会对鱼类的生长性能和健康状况产生负面影响[14]，而合适的糖脂比则可以在维持鱼类健康生理状态的同时提高生长效率和经济效益。合适的糖脂比相关研究在水产动物上已有许多，如罗非鱼(Oreochromis niloticus)[15]和克氏原螯虾(Procambarus clarkii)[16]等，而大菱鲆在最适蛋白水平条件下的糖脂比相关实验报道较少。
大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)是硬骨鱼纲鲽形目菱鲆科菱鲆属鱼类，有高经济价值，而因其肉质鲜美且快速成长，在欧亚地区被广泛养殖。现有研究表明，大菱鲆的蛋白最适需求范围约为50%[17]，而在此最适蛋白质水平的条件下，寻找能够维持养殖生物健康并提高生长表现的糖脂比组成是本研究的目标，通过探究不同糖脂比的饲料方案对大菱鲆幼鱼的生长性能和肝脏健康程度等生理指标的影响，了解大菱鲆对饲料中碳水化合物的利用能力和脂肪的利用能力之间的差异，并以此找出对大菱鲆最适的糖脂比，为大菱鲆的健康高效养殖提供理论支持。
1 材料与方法 1.1 实验饲料本实验饲料使用的蛋白源主要为鱼粉和酪蛋白，脂肪源为大豆卵磷脂和鱼油，碳水化合物源为糊精。以微晶纤维素作为饲料的填充剂，并添加防腐剂和黏合剂等配制5种不同糖脂比的等蛋白水平实验饲料。根据脂肪水平和糊精水平的不同，分别为D1、D2、D3、D4和D5(糖脂比值分别为2.01、1.53、1.25、0.96和0.71)5组。实验饲料组成及营养成分见表 1。
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表 1 实验饲料配方及主要营养成分(干物质) Table 1 Experimental feed formulation and major nutrient composition (dry matter) |
制作饲料的所有原料均经超微粉碎并过60目网筛，然后按照饲料配方中的配比由小到大逐级混匀，随后加入鱼油和大豆卵磷脂混匀后用制粒机制成直径3 mm的颗粒饲料。随后置于45 ℃恒温的烘箱中烘干约15 h。烘干后密封储存于-20 ℃冰箱。
1.2 养殖管理养殖实验在烟台国信东方循环水养殖科技有限公司(山东烟台)进行。实验开始前用均匀混合的5种实验饲料驯化1周，使大菱鲆适应养殖环境。驯化结束后，禁食24 h后挑选大小均匀、健康状态良好的大菱鲆(初质量(7.00±0.35) g)随机分为5个处理，每个处理3个重复，共15桶，每个重复40尾。在18 ℃的条件下分别投喂5种实验饲料，每日投喂3 mm实验饲料至饱食2次(7:30和19:30)，进行为期56 d的养殖实验。投喂后1 h记录残饵数量并每天定时观察大菱鲆摄食和健康状况。
养殖实验期间每日监测水质变化，使水温维持在(18.0±0.5) ℃，氨氮浓度低于0.1 mg/kg，亚硝酸盐浓度低于0.01 mg/kg，水中溶氧不低于7 mg/kg。
1.3 样品采集养殖实验结束后禁食24 h，对每桶的大菱鲆进行称重并记录，且每桶随机取5尾全鱼冷冻保存于-20 ℃冰箱用于测定体组成。将剩余的鱼进行饱食投喂，分别在投喂后0、2、6和12 h每桶随机取6尾鱼，取尾部静脉处血液、肝脏、中后肠。血液置于肝素钠抗凝管中，静置后在3 000 g、4 ℃条件下离心5 min，结束后吸取上清液存入1.5 mL离心管中并转移至-80 ℃冰箱中用于血浆生化指标分析。组织样品存入1.5 mL离心管中，放入液氮中速冻并转移至-80 ℃冰箱中用于染色切片、酶活和基因定量分析。
1.4 常规分析将样品置于105 ℃的恒温烘箱中烘干至恒重并测定其含水分量。粗蛋白测定使用烘干并粉碎的样品，通过杜马斯定氮仪(D200，海能仪器)进行测定。粗脂肪含量采用索氏抽提器(S0X606，海能仪器)进行测定。将样品放入设置燃烧温度为550 ℃的马弗炉中燃烧18 h后测定灰分含量。
1.5 肠道消化酶活性测定实验使用冷冻肠道样本进行测定。样本按照前文方法制备组织匀浆后使用南京建成生物公司的试剂盒测定肠道中的淀粉酶(Amylase)、胰蛋白酶(Trypsin)和脂肪酶(Lipase)的活性。使用时严格按照说明书的步骤进行。
1.6 血浆生化指标分析实验使用南京建成生物公司的试剂盒检测大菱鲆血浆中所含甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的浓度，使用时严格按照说明书的步骤进行。
1.7 肝脏糖原和甘油三酯分析实验使用冷冻肝脏样本进行分析。将样品在0.9% NaCl溶液中切碎，离心，并将上清液转移至新管中。肝糖原和甘油三酯的测定使用处理后的组织匀浆，使用南京建成生物公司的试剂盒测定，实验中严格按照说明书步骤进行。
1.8 肝脏油红O染色切片肝脏冷冻切片使用OCT冷冻切片包埋剂(SAKURA, 美国)包埋固定，使用冷冻切片机切出厚度为12 μm的切片。切片用北京索莱宝科技有限公司购买的油红O染色试剂盒进行染色，结束后用甘油和明胶进行封片。后进行电镜观察并拍照。
1.9 RNA提取和实时定量PCR肝脏RNA使用Trizol试剂盒(Takara, 日本)提取，提取好的RNA使用PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara，日本)按照说明书步骤将所提取的RNA反转录为cDNA。利用已有的目的基因引物进行实时定量PCR反应，实时定量PCR引物序列如表 2所示。qRT-PCR的反应体系为2×SYBR© Premix Ex TaqTM(Takara，日本)10 μL，dH2O 6.4 μL，cDNA(100 ng/μL)2 μL，正向引物(10 μmol/L)0.8 μL; 反向引物(10 μmol/L)0.8 μL; 反应程序如下: 95 ℃预变性2 min; 95 ℃变性5 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环。本实验所使用的内参基因为β-actin，且采用2-ΔΔCt方法计算各目的基因的相对表达量。
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表 2 实时定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for real-time quantitative PCR |
大菱鲆摄食率、特定生长率、蛋白质效率等数据参照以下公式计算:
增重率(Weight gain rate, WGR)=(大菱鲆末质量-大菱鲆初质量)/大菱鲆初质量×100%;
特定生长率(Specific growth rate, SGR)=(ln大菱鲆末质量-ln大菱鲆初质量)/实验天数×100%;
蛋白质效率(Protein efficiency rate, PER)=(大菱鲆末质量-大菱鲆初质量)/(摄食量×饲料蛋白水平);
摄食率(Feed intake, FI)= (摄食量/((大菱鲆初质量+大菱鲆末质量)/2))/实验天数×100%;
饲料利用率(Feed efficiency ratio，FER)=(大菱鲆末质量-大菱鲆初质量)/摄食量。
数据统计分析使用SPSS 25.0软件。实验数据采用单因素方差分析(ANOVA)并进行Tukey检验，在P < 0.05时视为有显著差异。文中数据以平均值±标准误(mean±S.E.)表示。
2 结果 2.1 大菱鲆幼鱼生长性能饲料不同糖脂比对大菱鲆生长性能的影响如表 3所示。D4组的WGR和SGR显著高于其他组，随着糖脂比降低呈先升高后降低的趋势。FI则是D1组显著高于其他组，呈下降趋势。PER呈现随着糖脂比下降先升高后降低的趋势，最高值出现在D4组，显著高于其他组。计算得出的FER显示，D4组显著高于其他组，而D1组则显著低于其他组。本实验中各组大菱鲆存活率皆为100%。
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表 3 不同糖脂比饲料对大菱鲆幼鱼生长性能的影响 Table 3 Impact of carbohydrate-to-lipid ratios in diets on juvenile turbot growth |
饲料不同糖脂比对大菱鲆幼鱼体组成的影响如表 4所示。各组鱼体组成的水分及灰分无显著差异。D1组的粗蛋白显著高于其他组(P < 0.05)。D1和D2组的粗脂肪水平显著低于其他组，而其他组之间的粗脂肪水平无显著差异(P < 0.05)。
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表 4 不同糖脂比饲料对大菱鲆幼鱼体组成的影响(干物质) Table 4 Diet carbohydrate-to-lipid ratios effects on juvenile turbot composition (dry matter) |
大菱鲆的肠道消化酶的活性如表 5所示，淀粉酶在D3组的活性显著高于其他组。脂肪酶的活性随着饲料中的脂肪水平提高而呈先上升后下降的趋势，其中D4组所测定的活性显著高于次高的D5组(P < 0.05)。胰蛋白酶的活性随着饲料中的糖脂比的比值下降而呈先上升后下降的趋势，峰值出现在D4组。
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表 5 肠道内消化酶活性 Table 5 Intestinal digestive enzyme activity |
如表 6所示，D4和D3组大菱鲆幼鱼血浆中的甘油三酯的含量显著高于其他组，整体趋势随着饲料中糖脂比下降而呈先上升后下降的趋势(P < 0.05)。
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表 6 不同饲料糖脂比配方对大菱鲆幼鱼血浆生化指标的影响 Table 6 Dietary carbohydrate-to-lipid ratios effects on turbot plasma biochemistry |
如表 6所示，总胆固醇(T-CHO)含量随着饲料糖脂比下降呈先上升后下降趋势，其中D4组的总胆固醇含量显著高于其他组(P < 0.05)。高密度脂蛋白(HDL-C)出现了D1和D2组显著低于D4组的结果，D3和D5组介于其中且无显著差异。随着饲料糖脂比下降，低密度脂蛋白含量呈先上升后下降趋势，其中D4组的低密度脂蛋白(LDL-C)含量显著高于其他组，而D5组则显著低于其他组(P < 0.05)。
2.5 大菱鲆肝脏糖原和甘油三酯如表 7所示，各处理组大菱鲆幼鱼肝脏的糖原和甘油三酯含量受饲料糖脂比影响显著，其中D4组大菱鲆幼鱼肝脏中的糖原显著高于其他组。D3和D4组大菱鲆幼鱼肝脏中的甘油三酯显著高于其他组(P < 0.05)。
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表 7 不同饲料糖脂比配方对大菱鲆幼鱼肝脏糖原和甘油三酯含量的影响 Table 7 Dietary carbohydrate-to-lipid ratios effects on turbot hepatic glycogen and triglyceride |
根据肝脏油红染色切片及分析(见图 1)可知，各处理组的大菱鲆肝脏中的脂滴占比随着饲料糖脂比下降而有差异。从切片中观察到，随着饲料中糖脂比上升，脂滴面积先上升，自D3后逐渐下降且趋于平稳。
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(糖脂比: D1:2.01;D2:1.53;D3:1.25;D4:0.96;D5:0.71。Carbohydrate-to-lipid ratio: D1:2.01; D2:1.53; D3:1.25; D4:0.96; D5:0.71.) 图 1 不同饲料糖脂比配方对于大菱鲆幼鱼肝脏的形态影响 Fig. 1 Dietary carbohydrate-to-lipid ratios effects on turbot juvenile hepatic morphology |
大菱鲆肝脏中代谢相关基因的相对表达量如图 2所示。D4组的gk表达量显著高于D1组，而D2组和其他各组之间无显著差异。D3和D4组的pk表达量显著高于D1和D2组，和D5组并无显著差异。D4组的pfk表达量显著高于D1、D2和D5组，相较D3组则无显著差异。D1组的pepck表达量显著低于其他组，而D5则显著高于其他组。fbase和g6pase的表达量皆呈现出随着饲料糖脂比降低而升高的趋势。
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(糖脂比: D1:2.01; D2:1.53; D3:1.25; D4:0.96; D5:0.71。同一行内上标字母相同或无字母表示差异不显著，不同上标字母表示存在显著差异(P < 0.05)，n=6。纵坐标为对应基因的表达量。Carbohydrate-to-lipid ratio: D1:2.01; D2:1.53; D3:1.25; D4:0.96; D5:0.71. The same superscript letter or no letter in the same row indicates that the difference is not significant, while different superscript letters indicate significant differences(P < 0.05), n=6. The vertical axis is the expression level of the corresponding gene.) 图 2 饲料中不同糖脂比对于大菱鲆能量代谢相关基因表达的影响 Fig. 2 Effects of different carbohydrate-lipid ratios in diet on the expression of energy metabolism-related genes in turbot |
如图 2所示，脂代谢相关的基因pgc1α和lipin1的表达量呈现出随着饲料糖脂比降低而先升高后降低的趋势。pparα和lpl的表达量呈现出随糖脂比降低而升高的趋势。脂肪合成相关的基因fas表达量在各组间无显著差异。脂肪运输相关的基因lxr表达量表现出了D1和D2组显著低于D3、D4和D5组的结果。
3 讨论本实验研究不同饲料糖脂比对大菱鲆的影响。本实验中大菱鲆幼鱼的WGR及SGR随着饲料的糖脂比降低而逐渐升高，但在到达D5组时开始降低，这与之前的研究结果相类似，如草鱼(Ctenopharyngodon idella)[18]、大鳞钩吻鲑(Oncorhynchus tshawy-tscha)[19]和土虱(Clarias batrachus)[14]等，这说明大菱鲆幼鱼的生长和转化效率会受饲料中的非蛋白质能量水平的影响。相对地，投喂过高或过低糖脂比的组生长性能较差，可能是因为肉食鱼对碳水化合物的利用能力有限[20]，而过高的糖脂比会导致鱼类体内脂肪过度堆积，进而使生长率下降，这与在罗非鱼(Oreochromis niloticus)上的现象类似[21]。根据本实验的结果可得知D1组的WGR和SGR皆低于D5组，这可以推测大菱鲆对于油脂的利用较碳水化合物的利用率高，或是相较于高碳水化合物，大菱鲆对高水平脂肪摄入的耐受性更低，这与El-sayed等在罗非鱼(Tilapia zillii)上的实验结果类似[22]。各组的存活率没有差异，表明这些糖脂比的营养水平是合适的，特别是满足了鱼的脂肪酸需求[18]。FI在饲料糖脂比低于一定比例后呈现出显著下降的趋势，结合PER的变化可以确定饲料中的脂质和糖的比例可以起到蛋白质节约的作用[23]。FER显著地受到饲料糖脂比的影响。随着糖脂比下降FER呈现先上升后下降的趋势，结果表明适当的糖脂比可以提高FER，过高或过低都会使其下降，该结果与以往的研究报告类似，如虹鳟(Salmo gairdneri)[24]、大西洋鲑鱼(Salmo salar)[25]和军曹鱼(Rachycentron canadum L.)[26]。
实验结果表明，随着饲料中的糖脂比下降鱼体中的脂肪含量也随着提高[27]。而剩余的过多脂肪则沉积在肌肉肠膜及肝脏等组织中，进而导致体脂肪含量增加[12]。这样的结果证明了鱼体脂质沉积和饲料中脂肪水平的相关关系。在杂交罗非鱼(Oreochromis niloti-cus×O. aureus)[28]和南美鸭嘴鲶(Pseudoplatystoma coruscans)[27]上有类似的结果。
本实验中淀粉酶的活性在D3组出现显著高于其他组，该结果与缢蛏(Sinonovacula constricta)[29]类似，可能说明该糖脂比例下大菱鲆对于碳水化合物的敏感度有所提高。脂肪酶的活性随着饲料中脂质水平上升而提高，这一结果说明脂质水平上升使脂肪酶和消化底物的反应面积增大，进而促进脂质消化[30]。胰蛋白酶的活性随着饲料的糖脂比呈先上升后下降的趋势，并与WGR、SGR和PER的趋势一致均在D4组出现最大值。这可能是因为该比例的饲料的糖脂比合适而使蛋白酶的活性保持在较高水平，进而提高蛋白的利用率，提升大菱鲆的生长性能。
实验结果显示，大菱鲆血浆中的甘油三酯含量随着饲料中的脂肪水平逐渐上升并在D4组时达到峰值后下降，且D4组及D3组甘油三酯含量显著高于其他组，由这项结果和总胆固醇趋势，推测可能是由于饲料中脂肪的含量上升的差异而导致，该结果与黄鳍鲷(Sparus latus)幼鱼类似[31]。HDL-C和LDL-C共同负责运输胆固醇[32]，而这些在鱼体中的含量随着饲料糖脂比的变化和大菱鲆体组成中脂质含量一致，表明其内源性脂质运输效率的高低与先前的研究结果类似[33]。
本实验中随着饲料糖脂比下降，肝脏中糖原的含量呈现先上升后下降的趋势。结果说明大菱鲆可以消化糊精并以糖原的形式累积于肝脏中，但过量的碳水化合物无法继续被转化。在其他研究中，如欧洲海鲈(Dicentrarchus labrax)[34]和军曹鱼(Rachycentron canadum L)[26]也发现了类似的结果。而大菱鲆的肝脏油红O染色切片显示，脂滴面积会随着饲料脂肪含量增加而先增加后减少，该结果与大菱鲆的体组成中的脂肪占比相互呼应。而该结果与瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)[35]和金带篮子鱼(Siganus rivulatus)[36]的结果一致。过往研究结果表明大菱鲆大部分脂肪堆积于肝脏中[37]。肝脏油红O染色结果显示，饲料中糖脂比的下降会使肝脏中脂滴的面积增加，且这种增加趋势与肝脏中甘油三酯含量的变化趋势一致。
为进一步探究大菱鲆幼鱼在不同饲料糖脂比下代谢的调节情况，本文进行了代谢相关基因的表达分析。本实验中，gk、pk和pfk的表达量随着饲料糖脂比的下降呈先上升后下降的趋势。饲料中碳水化合物比例的增加会提高糖酵解相关基因的表达量，这说明碳水化合物可以诱导肝脏gk的活性和基因表达，但D1、D2组的gk、pk、pfk的表达量显著降低，这表明饲料中合适的糖脂比可以促进大菱鲆对碳水化合物的利用。本实验中，当饲料糖脂比提高时，大菱鲆肝脏的pepck表达量显著降低，此结果可以说明高糖脂比下的pepck的活性遭到抑制，这一结果与大黄鱼(Larimichthys crocea)[38]和金鲳鱼(Trachinotus ovatus) [39]一致。随着饲料中碳水化合物水平提高，fbpase的表达量显著降低，这表明存在响应因饲料葡萄糖与脂质比例变化的潜在调节机制，这一结果与金头鲷(Sparus aurata)一致[40]。同时本研究还指出g6pase会因碳水化合物比例变化而产生调控，本实验中随着糖脂比下降，g6pase表达量也显著提高，导致该结果的原因可能与前者类似。
为进一步了解饲料糖脂比对大菱鲆幼鱼肝脏脂代谢的调节作用，本研究对脂代谢相关的基因表达量进行测定。本实验中，随着饲料糖脂比的降低，pgc1α表达量呈先增加后减少的趋势。lpl表达量随着饲料糖脂比下降而增加，且在D4组和D5组之间没有显著差异。而lipin1的表达量则是随着饲料糖脂比下降而呈先上升后下降的趋势。这一结果和在点带石斑鱼(Epinephelus coioides H.)[41]中观察到的结果相似。随着饲料糖脂比下降，pparα表达量显著提高。说明饲料糖脂比可以调节pparα的表达量。在暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)上有相似的结果[42]。随着饲料糖脂比下降，大菱鲆幼鱼肝脏的lxr基因的表达量出现显著的差异，D1和D2组的表达量显著低于D3、D4和D5组。这可以说明饲料中的过量游离脂肪进入肝脏。随着饲料糖脂比下降，fas的表达量在各组之间没有显著差异。根据过往研究的结果推测，随着饲料中糖脂比下降，包括fas在内的脂肪生成基因表达被下调[43-45]。
4 结语当饲料中糖脂比为0.96时，大菱鲆幼鱼能表现出最优的饲料利用率、生长率和特定生长率，同时在脂肪代谢上有较好的表现。D3组在碳水化合物的代谢上略微高于D4组。在生长方面高于或低于这个范围的糖脂比较差。以肝脏形态评估，D4略优于D3。综合以上论点可知，当饲料糖脂比值为0.96时，大菱鲆幼鱼可获得最好的生长和代谢性能，并且可以推论出相较碳水化合物，大菱鲆对脂肪的利用效果更好。
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