2025, Vol. 55
2. 青岛海洋科技中心 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266237;
3. 中国水产科学研究院长岛增殖实验站, 山东 烟台 265800
海带(Saccharina japonica)是养殖产量最高和产业影响力最大的经济海藻之一。海带的生活史由两个不同的世代组成，分别为大型的孢子体和小型的配子体，属于异形世代交替类型。海带配子体的生命周期包括三个阶段，首先是游孢子萌发成为初始配子体阶段，接下来是初始配子体生长和发育阶段，最后是有性生殖阶段。然而，在非适宜条件下，配子体仍然可以继续进行营养生长，即形成配子体克隆系[1]，具有发育全能性和遗传纯合的特点[2]，在低温、弱光和低营养盐的条件下可长期保存。由于具有上述特性，配子体克隆系成为海带种质保存的主要材料之一，也是海带遗传改良和新品种培育的原始材料[3-4]。配子体克隆系的营养生长和生殖发育是一个相互拮抗的过程，配子体在两者之间进行平衡调节[5-7]。在利用配子体进行育苗和育种过程中，首先需要进行快速营养扩繁以获得足量的配子体材料，其次是高效诱导配子体发育形成配子进而进行有性生殖。因此，配子体从营养生长向生殖发育转变的时间非常重要，直接影响到基于配子体克隆的育苗和杂交育种的效率。因此，研究海带配子体生长、发育和生殖的调控具有重要意义[8]。
前期研究主要集中在外部环境因子如温度、光照、营养盐等对配子体生长和发育的影响，例如，较低的温度利于配子体进行生殖发育，13~17 ℃的温度则有助于维持配子体的营养生长[9]。研究发现，一定比例的氮磷营养盐可以促进配子体生殖生长[10]，然而，鞠青等[11]研究则认为当氮磷比例超过15∶1时，会抑制配子形成。在海带的育苗过程中，铁能促进雌配子体生长发育，在海带卵子的发育过程中，铁的供应是不可或缺的[12]。光照通过光强、光周期和光质三个方面影响着配子体的营养生长和生殖发育，在较宽的光强梯度范围内，海带配子体都可以生长发育，随着光强的增大，配子体生长速度也会增加[13]。研究显示，研究显示，蓝光是一些海带生殖发育所必需的诱导条件[1, 7, 14]，与之相反，只有在低温和红光条件下，生殖现象才会被抑制[14]。此外，长光照有利于配子体的营养生长，而较短的光照则更有利于配子体的生殖[6, 14]。尽管已有大量关于外界环境因子调控海带配子体生长发育的研究，但是关于配子体内源因子对配子体生长发育的调控作用及其机制的研究却非常少见。
活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是氧在代谢过程中产生的氧化产物，包括超氧阴离子O2-、过氧化氢等。ROS来源于有氧代谢，并与细胞内的不同成分发生反应，导致细胞成分被氧化[15]。ROS通常被认为是有氧代谢的有毒副产物，然而最近越来越多的研究表明，ROS也可作为关键的信号转导分子，介导细胞内许多不同的生物学过程[16]。细胞增殖和分化是植物发育过程中至关重要的一环，Tsukagoshi等[17]发现，拟南芥根中的转录因子UPB1能直接调节过氧化物酶的表达，从而维持根细胞增殖区与细胞分化区之间ROS的平衡。当UPB1失活时，这种平衡被打破，导致根细胞的分化被延迟。这表明，ROS参与调控根尖分生组织中的细胞分裂和分化过程。此外，Yamada等[18]鉴定出了拟南芥根分生组织的生长因子RGF1，并发现RGF1与ROS之间存在相互作用，共同维持干细胞的生态位和根分生组织的大小。ROS平衡在植物细胞生长与分化过程中扮演着关键的角色，通过调节细胞的ROS平衡，调控细胞的增殖和分化，使得植物能够维持并调整细胞的发育命运。海带配子体克隆系的营养生长是一个细胞有丝分裂的过程，而生殖发育则是一个细胞分化形成配子的过程，ROS是否也参与海带配子体细胞分裂增殖与分化的调控，这是一个非常值得研究的问题。
海带配子体是海带生活史中的重要组成部分，其细胞体积小，生物量积累速度慢，而传统ROS检测方法需要的生物量多，导致配子体生长发育过程中的ROS水平变化难以检测。然而，一种名为H2DCFH-DA的活体荧光探针的应用为解决这一问题提供了新的途径。H2DCFH-DA是一种被广泛应用于动植物ROS研究中的荧光探针，与多种形式的ROS发生反应[19]。Fichman等[20]测试了几种不同的ROS荧光探针在拟南芥中的染色效果，发现H2DCFH-DA是最灵敏、效果最好的探针。此外，H2DCFH-DA还表现出了最高的信噪比，使其成为最佳的选择。研究人员使用该探针对拟南芥进行了整株活体ROS荧光成像，并测定了ROS在植株上的传播速度。目前H2DCFH-DA探针技术在藻类相关研究中的应用较少，例如朱竹君等[21]通过H2DCFH-DA探针研究了在琼胶寡糖处理条件下坛紫菜细胞中ROS产生位置及其产生量，但还没有在海带配子体中的应用报道。本研究首次将H2DCFH-DA探针应用到海带雌配子体ROS研究中，评价H2DCFH-DA探针在海带雌配子体中的灵敏度，探索一种研究配子体ROS相关问题的有力工具。
本研究以海带配子体为研究材料，通过探索雌配子体生长发育过程中的内源ROS水平变化规律，以及外源H2O2或ROS抑制剂对配子体生长和发育的影响，揭示ROS对海带配子体生长发育的调控作用，旨在加深对配子体克隆系生长和发育调控的认识，可为基于配子体克隆的杂交育种和苗种繁育提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法 1.1 实验材料所有配子体材料是本实验室培育的海带新品系“玉带1号”的配子体，保存在中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室的海藻种质库，编号为Yd-kH 2020，保存的条件是10 ℃、弱光(不超过9 μmol/(m2·s))、添加氮、磷营养盐(终浓度分别为4和0.4 mg/L)的灭菌海水。
用充气瓶作为容器对配子体进行扩培，每两周对配子体破碎并换水一次，同时收集长势较好的藻团放到锥形瓶中保存。扩培条件: 红光、光强18 μmol/(m2·s)、光周期16L∶8D、温度10 ℃，培养液为添加氮、磷营养盐终浓度分别为4和0.4 mg/L的灭菌海水。
1.2 培养条件诱导配子体生殖发育的条件: 白光45 μmol/(m2·s)，温度10 ℃，光周期8L∶16D，添加f/2培养液的灭菌海水，每3天换水一次。
配子体营养生长的条件: 红光22 μmol/(m2·s)，光周期16L∶8D，温度10 ℃，添加f/2培养液的灭菌海水，每3天换水一次。
1.3 机械破碎对海带雌配子体ROS产生与雌配子体发育的影响H2DCFH-DA染液的配制: 实验工作液采用10 μmol/L H2DCFH-DA染液，用于对配子体细胞中的ROS进行染色。
吸取适量雌配子体材料，用两个载玻片充分研磨，而后在载玻片上滴加适量海水培养。做6个培养载玻片分别对应于破碎后2 h、4 h、8 h、12 h、1 d和2 d实验组。按实验组时间节点提前0.5 h吸干载玻片上的海水，滴加适量的10 μmol/L H2DCFH-DA染液，黑暗、10 ℃条件下孵育30 min，再把染液吸干，滴加适量海水复原5 min，在荧光显微镜下拍荧光照片和明场照片。每个观察时间点分别选取3张200倍镜下拍得的荧光照片，利用ImageJ分别测定3张照片中所有雌配子体的荧光强度，再通过取平均值得到最终的平均荧光强度。
1.4 配子体形成与生长、发育过程中ROS变化选取成熟孢子体，用海水多次清洗孢子体，清除孢子体表面的附着物，而后放在海水中使孢子囊释放出游孢子，当孢子的密度合适后(显微镜下100倍视野可以观察到10个左右的游孢子)，使用300目筛绢过滤得到干净的孢子水，载玻片置于孢子水中，使游孢子在载玻片上附着。待30 min后游孢子附着在载玻片上，在显微镜下100倍视野中观察载玻片，可以观察到15个左右孢子，此时将所有载玻片从孢子水中移出并放入盛有灭菌海水的染缸中，在10 ℃、黑暗条件下保存。
游孢子在黑暗保存过程中已转化为初始配子体。取染缸中的载玻片(12片)，平均分为两组，一组放在配子体营养生长条件下培养，定义为营养生长组，一组放在诱导配子体发育和生殖的条件下培养，定义为生殖发育组，两组均在培养1、3、6、9和12 d时，经H2DCFH-DA染液染色后，在荧光显微镜下拍荧光照片和明场照片。营养生长组和生殖发育组的每个观察时间点分别选取3张200倍镜下拍得的荧光照片，利用ImageJ分别测定3张照片中所有雌配子体的荧光强度，再通过取平均值得到最终的平均荧光强度。
1.5 人工调控ROS水平对配子体生长发育的影响H2O2培养液的配制: 实验组设置了0、0.05、0.1和0.3 μmol/L 4个浓度，对照组不加H2O2，每个浓度设置3个平行组。
ROS抑制剂DPI培养液的配制: 实验组设置了0、0.05和0.1 μmol/L 3个浓度，对照组不加DPI，每个浓度设置3个平行组。
先从保种锥形瓶中用移液枪各吸取雌、雄配子体藻团分别置于载玻片上，仅在正常培养条件下培养，作为对照组。而后分别吸取雌雄配子体，按雌、雄配子体2∶1的比例混合，用匀浆仪将雌雄混合材料打碎，10 s/次，打碎13次，对破碎后的配子体进行稀释，直至显微镜100倍视野下可以观察到5~8个配子体。将稀释后的配子体平均分配，倒入6个直径12 cm的培养皿中，每个培养皿中放置3个载玻片代表 3个平行实验组，分别添加上述不同浓度的H2O2和DPI进行处理，每隔3 d使用LAS X显微镜拍摄配子体照片，每个载玻片拍摄10张100倍视野下的照片，观察配子体的生长发育情况。选取培养12 d和培养15 d时拍得的照片，统计每个载玻片拍得的10张照片中的卵囊形成数、排卵数、幼孢子体数和总细胞数，而后计算配子体发育率，发育率为卵囊形成数、排卵数和幼孢子体数之和占总细胞数的百分比[2]。
1.6 数据处理使用GraphPad Prism 8.3.0进行所有数据的统计分析和条形图绘制，并通过单因素方差分析以及Duncan Post Hoc多重比较进行差异显著性分析(P < 0.05)。数据以平均值±标准差的形式表示。
2 结果与分析 2.1 破碎对海带雌配子体ROS水平的影响如图 1所示，营养生长条件下，海带雌配子体破碎后2 h还没有产生ROS的荧光信号，破碎后4 h，开始产生微弱的ROS荧光信号，破碎后4~12 h，ROS荧光信号不断增强，于破碎后12 h达到最强，破碎后12~48 h，ROS荧光信号逐渐减弱，至破碎后48 h时荧光信号基本检测不到。
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(a—f: 海带雌配子体破碎后2、4、8、12、24和48 h的明场照片及ROS荧光照片，图中雌配子体是从荧光显微镜400倍观察视野中随机选出的代表，实际荧光强度是由200倍观察视野中多个雌配子体细胞段荧光强度通过计算平均值得到。标尺=20 μm。a—f: Bright-field and ROS fluorescence images of S. japonica female gametophytes cultured for 2, 4, 8, 12, 24, and 48 h following disruption. The female gametophytes presented in this figure are representative samples randomly selected from a 400× magnification field of view using a fluorescence microscope. The reported fluorescence intensity was derived by calculating the mean fluorescence intensity across multiple female gametophyte cell segments observed within a 200× field of view. Scale bar represents 20 μm.) 图 1 破碎后海带雌配子体ROS变化 Fig. 1 Variations in ROS levels in S. japonica female gametophytes following disruption |
利用ImageJ软件对荧光显微镜拍得的荧光照片进行处理，将雌配子体ROS的荧光强度转化为平均灰度值，每个处理组的每个观察时间点至少统计3张照片中至少30个雌配子体的灰度值，进而表征破碎不同时间后雌配子体的ROS水平变化。由图 2可知，在营养生长条件下，破碎后2 h尚未检测到ROS的荧光信号，破碎后4 h荧光信号快速增强，显著超过破碎后2 h的荧光信号强度，荧光信号快速增强一直持续到破碎后12 h，并达到顶峰; 破碎后24~48 h，荧光信号开始显著降低，破碎后48 h信号几乎降低为0。
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(柱状图上不同小写字母表示荧光强度差异性显著(P < 0.05)。Significant differences in fluorescence intensity are indicated by distinct lowercase letters on the bar chart (P < 0.05).) 图 2 破碎后海带雌配子体荧光强度变化 Fig. 2 Variations in fluorescence intensity in S. japonica female gametophytes following disruption |
如图 3所示，初始配子体在生殖发育条件下发育第1天时，形成微弱的ROS荧光信号，在第1~12天，荧光信号逐渐增强并在第12天达到最强。从明场照片中可以推测出，初始配子体细胞在1~6 d分化形成雌配子体，6~9 d雌配子体细胞体积不断增大，在9~12 d期间形成卵囊、排卵，在第12天形成小苗，此时ROS荧光信号达到最强。
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(a—e: 海带初始配子体培养1、3、6、9和12 d时的明场照片及ROS荧光照片，图中雌配子体是从荧光显微镜400倍观察视野中选出的典型代表，实际荧光强度是由200倍观察视野中多个雌配子体细胞段荧光强度通过计算平均值得到。标尺=20 μm。a—e: Bright-field and ROS fluorescence images of initial S. japonica gametophytes cultured for 1, 3, 6, 9, and 12 d. The female gametophytes presented in the images are typical representatives selected from a 400× magnification field of view under a fluorescence microscope. The reported fluorescence intensity was obtained by averaging the fluorescence intensities of multiple female gametophyte cell segments observed within a 200× magnification field of view. Scale bar represents 20 μm.) 图 3 初始配子体形成雌配子体并经发育、受精形成幼苗过程中ROS变化 Fig. 3 Variations in ROS during the transition from initial gametophytes to female gametophytes and their subsequent development through fertilization into seedlings |
由图 4可知，在初始配子体形成雌配子体并经发育、受精形成幼苗的过程中，培养第1天检测到细胞形成ROS荧光信号，培养1~9 d ROS信号显著升高，并在第9天达到最大值，培养第12天的荧光信号与第9天相比无明显变化。培养1~12 d荧光信号没有下降的趋势。
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(柱状图上不同小写字母表示荧光强度差异性显著(P < 0.05)。Significant differences in fluorescence intensity are denoted by distinct lowercase letters on the bar chart (P < 0.05).) 图 4 初始配子体形成雌配子体并经发育、受精形成幼苗过程中荧光强度变化 Fig. 4 Variations in fluorescence intensity throughout the process of female gametophyte formation from initial gametophytes, followed by development and fertilization into seedlings |
如图 5所示，初始配子体在营养生长条件下发育第1天，形成微弱的荧光信号，在第1~9天处于营养生长时，荧光信号逐渐增强并在第9天达到最强，在第9~12天，荧光信号开始逐渐减弱。从明场照片中可以推测出，初始配子体细胞在1~6 d经分化成为雌配子体，6~9 d体积不断增大，9~12 d雌配子体细胞开始进行有丝分裂并在第12天分裂形成多细胞配子体，此时ROS荧光信号较第9天时显著减弱。
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(a—e: 海带初始配子体培养1、3、6、9和12 d时的明场照片及ROS荧光照片，图中雌配子体是从荧光显微镜400倍观察视野中选出的典型代表，实际荧光强度是由200倍观察视野中多个雌配子体细胞段荧光强度取平均值得到。标尺=20 μm。a—e: Bright-field microscopy and ROS fluorescence images depict S. japonica initial gametophytes cultured for 1, 3, 6, 9 and 12 d, respectively. The female gametophytes presented in this figure are representative specimens chosen from a 400× magnification observation field using a fluorescence microscope. The reported fluorescence intensity values were derived by calculating the mean fluorescence intensities of multiple female gametophyte cell segments observed within a 200× magnification field of view. Scale bar represents 20 μm.) 图 5 初始配子体形成雌配子体并进行营养生长过程中的ROS变化 Fig. 5 Variations in ROS levels during the transition from initial gametophytes to female gametophytes and their subsequent vegetative growth |
由图 6可知，在初始配子体营养生长过程中，培养第1天细胞产生荧光强度，在之后的1~9 d荧光强度显著升高并在第9天达到最大值，培养第12天时细胞分裂为多细胞体，荧光强度显著下降，且与培养第3天时的荧光强度相比无显著差异。可见ROS荧光信号先增加后降低。
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(柱状图上不同小写字母表示荧光强度差异性显著(P < 0.05)。Significant differences in fluorescence intensity (P < 0.05) are denoted by distinct lowercase letters on the bar chart.) 图 6 初始配子体形成雌配子体并进行营养生长过程中的荧光强度变化 Fig. 6 Variations in fluorescence intensity throughout the process of initial gametophyte development into female gametophytes and their subsequent vegetative growth |
对比两组实验结果可以发现，雌配子体在前期生长发育过程中，ROS呈不断上升的趋势，如条件适宜，雌配子体细胞形成配子囊，进入生殖状态，ROS继续保持高水平; 而当条件不适合生殖时，雌配子体转入到细胞分裂状态，雌配子体细胞不会分化形成雌配子囊，此时伴随着ROS水平的降低。
2.3 人工调控ROS水平对配子体生长发育的影响海带配子体破碎后在生殖发育条件下培养0~3 d(见图 7a)，配子体细胞段附着在载玻片表面，雄配子体细胞大小显著小于雌配子体细胞。破碎后培养6~9 d(见图 7b)，雌配子体相邻细胞由之前的形状、大小相近转变为形状各异、大小不等，雄配子体细胞经过之前的不断分裂, 其细胞段长度增加，此时配子体由营养生长转变为生殖发育。破碎后培养第12天，部分雌配子体细胞表面出现突起开始形成椭球形卵囊(见图 7c)，有的细胞进一步发育开始排出圆球状的卵(见图 7d)。破碎后培养第15天，雌配子体排出的卵与雄配子体放散的精子结合，合子生长发育为幼孢子体(小苗)，刚形成的幼孢子体细胞只进行纵分裂，为单列细胞小苗(见图 7e)，随后开始进行横分裂，形成多列细胞小苗(见图 7f)。
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(a: 海带配子体破碎后培养初期; b: 海带配子体由营养生长向生殖发育转变过程中的形态变化; c—d: 海带雌配子体形成卵囊、排卵; e—f: 海带雌配子体形成单列细胞小苗、多列细胞小苗。标尺=50 μm。a: Initial stage of culture after the fragmentation of S. japonica gametophytes; b: Morphological transitions during the shift from vegetative growth to reproductive development in S. japonica gametophytes; c—d: Formation of oogonia and ovulation events in S. japonica female gametophytes; e—f: Development of single-cell seedlings and multi-cell seedlings in S. japonica female gametophytes. Scale bar represents 50 μm.) 图 7 破碎后海带配子体的生长发育和生殖过程 Fig. 7 Growth, development, and reproductive processes of S. japonica gametophytes following disruption |
在加入不同浓度H2O2和DPI条件下，海带配子体经破碎后在生殖发育条件下进行培养。破碎后培养12 d，添加DPI实验组的配子体发育率均为0，低于无任何添加剂对照组的发育率(9.37%)(见图 8)。添加0.05 μmol/L H2O2实验组的发育率为21.3%，显著高于无任何添加剂的对照组，随着H2O2浓度增加至0.1和0.3 μmol/L，对应浓度实验组的发育率逐渐降低为14.6%和7.77%，其中0.3 μmol/L H2O2实验组的发育率低于对照组(见图 8)。如图 8所示，破碎后培养15 d，添加0.1 μmol/L DPI实验组的配子体发育率为4.2%，显著低于添加0.05 μmol/L DPI实验组的配子体发育率(12.4%)，两个添加DPI实验组的发育率又显著低于无任何添加剂对照组的发育率(39.63%)。如图 8所示，0.05 μmol/L H2O2实验组的配子体发育率为48.53%，显著高于对照组; 随着H2O2浓度升高，配子体的发育率开始出现下降趋势，0.1和0.3 μmol/L H2O2实验组的发育率分别为45.1%和43.87%，与对照组无显著差异。可见ROS抑制剂DPI能显著抑制海带配子体的生长发育，而适宜浓度的H2O2促进配子体的生殖发育，但是随着H2O2浓度升高，其对配子体生殖发育的促进作用呈现下降趋势。
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(柱状图上不同小写字母表示培养12 d配子体发育率差异的显著性(P < 0.05);不同大写字母表示培养15 d配子体发育率差异的显著性(P < 0.05)。The bar chart illustrates significant differences in the developmental rates of gametophytes cultured for 12 days, denoted by distinct lowercase letters (P < 0.05). Similarly, significant differences in the developmental rates of gametophytes cultured for 15 days are indicated by distinct uppercase letters (P < 0.05).) 图 8 人工调控ROS水平对配子体生长发育的影响 Fig. 8 Impact of artificially manipulating ROS levels on the growth and development of gametophytes |
植物在受到创伤时有很强的自愈能力和防御机制。创伤可以是机械性的，例如受到撞击或割伤，也可以是生物性的，如虫的啃食或细菌的侵染。植物会通过一系列复杂的反应来应对这些创伤，促进创伤愈合并保护自身免受进一步的伤害。这个过程涉及创伤信号的产生、传递、感知和转导，进而促使创伤相关基因的表达[22]。其中，ROS是参与植物伤口信号传导的重要因子。Minibayeva等[23]发现在小麦的受损根部渗出液中O2-的浓度是未受损根部渗出液中的两倍，这表明在小麦根部受损伤的过程中，过氧化物酶体释放的ROS参与了小麦的应激反应，帮助植物迅速应对外部损伤。不仅如此，藻类在受到机械损伤时也有相似的反应。例如，蠕形绒枝藻在受伤处释放出NO和H2O2这两种ROS。这些ROS可以调节伤口处过氧化物酶的活性，进一步促进伤口的愈合过程[24]。同样，Mcdowell等[25]发现糖海带在受伤后也会产生大量的ROS，他们研究了南极地区的13种大型藻类，发现在受伤后的1 min内，绝大多数物种就释放出ROS，或者在受伤后的1 h内细胞积累了大量的ROS。本研究中发现，随着破碎(机械损伤)后时间延长，海带雌配子体荧光强度先从0开始增加，达到最大值后又逐渐降低为0，说明破碎会导致海带雌配子体ROS产生，一段时间后，破碎产生的ROS信号又会逐渐消失。
而破碎常用来诱导配子体由营养生长向生殖发育转变，据此我们推测ROS也可能是促进配子体生殖发育的关键信号分子。本研究发现在生殖发育条件下随培养时间延长，雌配子体的内源ROS荧光强度不断增加，在形成小苗时荧光强度达到最大，这表明在雌配子体营养生长阶段，ROS水平逐渐提高，当雌配子体转向生殖发育时，ROS水平进一步上升。在营养生长条件下，随培养时间延长雌配子体内源ROS荧光强度先增加后降低，说明在雌配子体营养生长过程中，ROS水平先上升后下降。由此我们推测ROS可能是配子体启动生殖发育的内部信号。
为了验证上述推测，我们进一步研究了外源添加ROS或ROS抑制剂(DPI)对配子体生长发育的影响。发现添加ROS抑制剂DPI会使配子体发育率降低，随着DPI浓度增加，配子体发育率继续降低，说明DPI对配子体生殖发育具有抑制作用，且DPI浓度增加会加剧对配子体生殖发育的抑制程度。破碎后培养12 d时，添加0.1 μmol/L DPI和添加0.05 μmol/L DPI实验组的配子体发育率均为0，而在破碎后培养15 d时，这两个实验组的发育率明显上升，但是依然显著低于对照组，这可能是由于DPI对配子体生殖发育的抑制效果随作用时间的延长逐渐减弱。添加低浓度H2O2会使配子体发育率升高，随着H2O2浓度增加，配子体发育率降低，说明低浓度H2O2对配子体生殖发育有促进作用，而高浓度的H2O2对配子体生殖发育的促进效果减弱，甚至有抑制作用。
海带配子体营养生长是一个细胞有丝分裂过程，而生殖发育是配子发生的过程，也是一个细胞分化过程，即配子体细胞停止有丝分裂进而分化形成配子，因此配子体从营养生长转向生殖发育在本质上是细胞从分裂增殖转向分化发育的过程。Petrˇivalsky′等[26]使黄瓜叶肉原生质体分离，检测到原生质体中ROS大量积累，而原生质体经过ROS内源清除剂抗坏血酸处理后，研究者观察到细胞密度降低，愈伤组织的形成受到抑制。Orłowska等[27]跟踪观察了蒺藜苜蓿外植体形成体胚过程中ROS含量变化，再通过添加ROS抑制剂DPI成功抑制了该过程，进而发现ROS是外植体诱导形成体胚的关键信号分子。Takahashi等[28]通过添加H2O2培养条斑紫菜叶状体，发现单孢子的产生量增多，释放速度加快，同时发现H2O2能诱导小部分孢子体萌发，说明ROS可能通过一些信号通路诱导叶状体营养细胞的分裂与分化。综合以上高等植物和其他藻类中的研究结果，可见ROS是一种信号分子，参与调控细胞的有丝分裂与重编程过程，诱导原生质体恢复、外植体形成体胚和单孢子放散。因此，我们推断ROS也可能参与调控海带配子体细胞的分裂与分化过程。
4 结语本研究首次成功将H2DCFH-DA荧光探针应用到海带雌配子体ROS研究中，并发现ROS是调控配子体生长发育的内部信号。以上研究结果增进了对海带配子体生殖发育调控机制的理解，为将来海带配子体生殖发育调控研究提供了新的研究视角，也为海带配子体克隆育苗技术和杂交育种技术的改进提供了参考。
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2. Functional Laboratory for Ocean Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao Ocean Science and Technology Research Center, Qingdao 266237, China;
3. Changdao Enhancement and Experiment Station, the Chinese Academy of Fishery Sciences, Yantai 265800, China