2024, Vol. 54
龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)隶属于红藻门(Rhodophyta)、红藻纲(Rhodophyceae)、真红藻亚纲(Florideae)、杉藻目(Gigartinales)、江蓠科(Gracilariaceae)，是一种非常重要的大型海洋经济红藻[1]。
龙须菜具有三世代型(多管藻型)的生活史，由二倍体的四分孢子体(Tetrasporophyte)、附生在雌配子体上的果孢子体(Carposorophyte)及单倍体的雌雄配子体(Gametophyte)这三个世代组成[2]。龙须菜的四分孢子体发育分为4个阶段，未成熟期(Phase Ⅰ)即四分孢子囊未形成时期、成熟前期(Phase Ⅱ)即四分孢子囊开始形成但未有四分孢子放散时期、成熟期(Phase Ⅲ)即四分孢子大量放散时期和成熟后期(Phase Ⅳ)即四分孢子基本放散留下大量孔洞时期[3]。龙须菜良种981具有耐高温、速生抗逆和琼胶含量高等优良特性[4]，且在其四分孢子体发育阶段表现出异于其他品系龙须菜的特征，表现出如产生的四分孢子量少、形成的四分孢子囊和四分孢子畸形、四分孢子破裂、有内容物流出以及颜色异常等低育的特征[5]。而本研究组以往研究发现，另一品系WLP-1，则表现出易成熟的特性。对龙须菜不同育性品系的深入系统研究，可为今后龙须菜育种提供理论依据。
王津果[3]通过数字表达谱(Digital gene expression, DGE)分析，比较了龙须菜良种981和“鲁龙1号”在四分孢子体不同发育阶段基因表达水平的变化。姜敏杰等[6]通过KEGG代谢通路富集分析发现有30个参与细胞过程的基因，其中10个在龙须菜良种981的Ⅱ期表达下调，而另外20个基因表达上调[6]，表达上调的基因中包括细胞周期检查点基因 RAD17 。
细胞周期检查点是生物体在长期进化过程中形成的一套确保DNA复制和染色体分配质量的检查机制[7]。当植物体DNA遭受损伤时，检查点被激活, 从而导致细胞周期发生阻滞，待DNA修复完全，细胞周期恢复运行；当损伤严重时，细胞走向程序性死亡[8-9]。检查点系统包含感受器、传感器和效应器[10-11]。在芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)及人类(Homo sapiens)的细胞中，对细胞周期检查点已有深入了解[12-16]；近年来，植物中，特别是拟南芥中，相关的研究也颇为详尽[17-18]。这些研究还表明，检查点控制在进化过程中是高度保守的。然而，关于藻类细胞周期检查点调控信息较少。莱茵衣藻作为研究细胞周期调节和DNA修复基本细胞过程的模式生物，目前其细胞周期检查点的研究仅仅只有ATR和ATM同源物的确认[19-20]，在细胞周期检查点通路组分及如何应对DNA损伤方面还未见相关报道。而在红藻中，关于细胞周期检查点的相关研究更是鲜有报道。
植物育性与生殖发育不仅同植物繁衍后代息息相关，也是作物杂种优势利用技术的遗传基础[21]。植物的育性与细胞周期检查点调控紧密关联，例如拟南芥中：ATM突变体无法有效诱导DNA损伤的修复和检测相关基因的转录，导致部分个体不育[22]；在减数分裂过程中，细胞周期检查点提供完整的协调机制，其调控对于确保配子的产生至关重要[23]；在重组过程中，为保证同源基因能正确分配到配子中，细胞周期检查点的调控也是必不可少的[24]。因此，细胞周期检查点基因成为了研究育性调控机制的重要靶点。不仅育性性状的解析具有重要理论意义，而且低育品系也具备潜在的产业应用价值。然而，目前对于大型红藻育性的研究尚显不足，对育性及其调控的解析亟待更深入地研究。
为深入解析龙须菜中细胞周期检查点特征，并探究该通路在龙须菜四分孢子体发育过程中的作用，本研究选取龙须菜基因组注释中的细胞周期检查点基因，通过基因序列分离、基因特征分析和表达分析，阐述细胞周期检查点在龙须菜不同品系四分孢子体发育过程中参与的调控作用。本研究的理论结果不仅有助于深入了解龙须菜育性的调控机理，同时在产业应用中可为优良品系的选育提供指导和依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料龙须菜良种981和品系WLP-1经实验室单克隆扩繁后，被挂养于威海荣成海区(37°6′N，122°25′E)，分别于2021年9—10月以及2022年8月至2022年9月进行了采集。与此同时，野生型龙须菜于2021年9—10月从青岛胶州湾养殖海区(36°08′N，120°17′E)进行了采集。对于采集后的实验材料，先用海水冲洗3次，再用灭菌海水冲洗并用灭菌后的毛刷刷掉龙须菜表面的附生生物和杂质，然后挑选生长状态良好的藻体置于灭菌的广口锥形瓶中，加入含有pro培养基的灭菌海水，置于光照条件为50 μmol·m-2·s-1、温度为(20± 1)℃、光暗周期比为12 h∶12 h的培养条件下进行驯化，每3天更换1次含Prorasoli(Pro)培养基的海水，经一周实验室驯化后，对这些藻体进行了镜检，以评估其四分孢子体的发育阶段。
为了详细观察和分析龙须菜不同品系四分孢子体的发育过程，我们每周在光学显微镜下分别对良种981、野生型龙须菜以及WLP-1品系四分孢子体发育的Ⅰ~Ⅲ阶段的材料进行镜检，并依据龙须菜不同发育阶段的特征判断藻体的发育时期[3]。镜检完毕后，用消毒刀片从镜检藻体中取样0.2 g，并标记它们所处的不同发育阶段(Ⅰ~Ⅲ阶段)，随后样品迅速放入液氮中速冻，并最终置于-80 ℃冻存。培养2~3周后，再次分别对以上材料进行镜检，从而获得良种981、野生型龙须菜以及WLP-1品系的Ⅰ~Ⅲ阶段材料，其中每个阶段取3份作为平行样。
1.2 基因组DNA的提取及cDNA的制备利用植物基因组DNA提取试剂盒(品牌：天根)提取样品中基因组DNA；利用植物RNA提取试剂盒(品牌：OMEGA)提取样品中的RNA。利用NanoPhotometer N60测定所提取的RNA的浓度及其OD260/OD280值，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。之后，利用反转录试剂盒(品牌：Takara)将提取的RNA反转为cDNA，置于-20 ℃保存。
1.3 目标基因的克隆与分析利用PrimerPremier5.0设计基因克隆的引物(见表 1)，以cDNA为模板，扩增目的基因片段。PCR反应体系中含有2 × Phanta Max Master Mix 25 μL、正向引物(10 μmol/L)1 μL、反向引物(10 μmol/L)1 μL和模板DNA 5 μL，并使用无菌超纯水补齐到体积50 μL。PCR反应程序设定为：95 ℃预变性3 min，1个循环；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸(30~60 s/kb，时间根据目标基因片段的长度确定)，35个循环；72 ℃延伸5 min。扩增后，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(品牌：天根)对产物进行纯化，从而将目的条带从凝聚中回收出来，然后将回收后的目的条带连接pMD19T载体(品牌：诺唯赞)，构建重组质粒，转化至感受态大肠杆菌DH5α(品牌：诺唯赞)中，将单菌落接种于含Amp+(50 mg/mL)的LB培养基中，放入摇床中(37 ℃，110 r/min)震荡培养6 h，以菌液为模板，用pMD19-T载体上的M13F/R通用引物和基因的特异引物进行菌落PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，将片段大小正确的菌液送至上海生工生物公司进行双向测序。
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表 1 本研究所用到的引物 Table 1 The sequence of primers used in this study |
用MEGA7.0软件检查双向测序的结果，并与本实验室的基因组序列进行比对。利用美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)官网的ORF Finder在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测开放阅读框，然后用MEGA7.0软件将DNA序列翻译成氨基酸序列。蛋白质的分子量与等电点等基本理化性质使用ExPASy在线软件(http://web.expasy.org/protparam)进行预测；利用SignalP 4.1在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析蛋白信号肽；通过TMHMM在线软件(http://www.ch.embnetorg/software/TMPREDform.html)对跨膜区进行分析；利用NCBI的Conserved Domain Search在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和SMART在线软件(http://smart.embl-heidelberg.de)共同对蛋白质功能结构域进行分析；将获得的氨基酸序列通过NCBI的BLASTP在线软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)进行同源序列比对查询，下载相似度排在前15位的氨基酸序列，同时加入芽殖酵母(S. cerevisiae)、裂殖酵母(S. pombe)和人(H. sapiens)的同源氨基酸序列作为参照，通过NCBI的Batch CD-Search在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)提取蛋白序列的功能结构域，并通过MEGA7.0软件进行多重比对分析，用GeneDOC软件可视化比对结果；通过MEGA7.0软件构建NJ系统进化树，Bootstrap设置为1 000次重复。利用Plant- CARE软件对上游启动子顺式作用元件进行分析，每个基因的预测区域为转录起始位点上游的2 000 bp序列。利用在线软件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对基因的二级结构进行预测。
1.5 基因表达分析利用PrimerPremier5.0软件设计定量引物(见表 1)，克隆测序步骤遵循1.3节所述。利用质粒提取试剂盒(品牌：天根)提取质粒，这些质粒将作为模板用于后续荧光定量引物扩增效率及扩增曲线检测。PCR反应体系中，添加了10 μL的Hieff UNICON Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix，并加入正、反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL，以及1 μL的模板，剩余的体积用无菌超纯水补齐到20 μL。在Roche Light Cycler 480实时定量PCR仪器中进行实时荧光定量PCR反应，遵循以下反应程序：95 ℃ 2 min，1个循环；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，1个循环；40 ℃ 30 s，1个循环。
为了评估引物的扩增效率，以提取的质粒为模板，按照1∶10的梯度用无菌水对质粒进行稀释，每个梯度设置3个技术重复进行荧光定量PCR反应，PCR反应体系及反应程序与前述步骤保持一致。
根据荧光定量获得的循环阈(Cycle threshold，Ct)值绘制标准曲线，评估荧光定量引物是否符合要求(扩增效率的范围是95%~105%)。龙须菜中的18S rRNA表达恒定，因此在本研究中用作参照基因。以不同品系不同发育阶段的cDNA为模板，每个样品设置3个生物学平行，每个生物学平行设置3个技术重复，依照上述步骤分别对基因进行荧光定量PCR反应。
2 结果 2.1 细胞周期检查点相关基因全基因组筛选细胞周期检查点调节机制在生物界中广泛存在，从简单的单细胞真核生物到哺乳动物均展现出相似的调控模式，这一机制先后在芽殖酵母(S. cerevisiae)和裂殖酵母(S. pombe)中被发现，随后又分别在小鼠和人中分离克隆了细胞周期检查点基因。本研究以酵母和人的细胞周期检查点机制为参考，选择该通路中作为感受器组分的ATR、ATM、RAD17和RAD9为研究对象，通过NCBI Conserved Domains，对包括龙须菜的4个代表性物种中的这4种基因的蛋白序列进行结构域分析，结果如图 1—4所示。
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( (A)人H. sapiens(NP_001175. 2); (B)裂殖酵母S. pombe(CAA70297. 1); (C)芽殖酵母S. cerevisiae(KZV13216. 1); (D)龙须菜G. lemaneiformis(LXC002620. 1). ) 图 1 ATR在不同物种的结构域分析 Fig. 1 Domain analysis of ATR in different species |
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( (A)人H. sapiens(NP_000042. 3); (B)裂殖酵母S. pombe(NP_588126. 1); (C)芽殖酵母S. cerevisiae(NP_009465. 2); (D)龙须菜G. lemaneiformis(LXC006505. 1). ) 图 2 ATM在不同物种的结构域分析 Fig. 2 Domain analysis of ATM in different species |
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( (A)人H. sapiens(NP_001265551. 1); (B)裂殖酵母S. pombe(NP_594918. 1); (C)芽殖酵母S. cerevisiae(NP_011100. 1); (D)龙须菜G. lemaneiformis(LXC006505. 1). ) 图 3 RAD17在不同物种的结构域分析 Fig. 3 Domain analysis of RAD17 in different species |
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( (A)人 H. sapiens(NP_001230153. 1); (B)裂殖酵母S. pombe(NP_593455. 1); (C)芽殖酵母S. cerevisiae(NP_015130. 1); (D)龙须菜G. lemaneiformis(LXC000968. 1). ) 图 4 RAD9在不同物种的结构域分析 Fig. 4 Domain analysis of RAD9 in different species |
由图 1可见，4个物种的ATR共同含有PIKKc-ATR激酶结构域，长度均为273个氨基酸，位于该氨基酸序列的C端。ATR为磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)相关激酶(PIKK)蛋白家族成员，所有PIKK成员在C末端都有一个高度保守的激酶结构域[25]。
由图 2可见，4个物种的ATM共同含有PIKKc-ATM激酶结构域，长度均为282个氨基酸，位于该氨基酸序列的C端。ATM与ATR的结构域具有一定的相似度，共同属于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)相关激酶(PIKK)蛋白家族成员[26]。
由图 3可见，4个物种的RAD17都属于RAD24蛋白家族，均含有RAD17/RAD24结构域，该结构域位于其氨基酸序列第1—640位，长度为均637个氨基酸。
由图 4可见，RAD9结构域分析显示存在RAD9结构域及PCNA结构域。其中RAD9结构域是响应DNA损伤所必需的，该结构域位于其氨基酸序列第1—300位，长度均为253个氨基酸。当发生DNA损伤时，RAD9、RAD1和Hus1形成RAD9-RAD1-Hus1(9-1-1)检查点复合物，特异性地围绕受损DNA周围，激活细胞周期检查点通路，从而阻滞细胞周期进程[27]，对DNA进行修复[28]。形成的9-1-1复合物与同源三聚体环形的增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)，具有很高的结构相似度，类似一种环状滑动钳，参与真核生物DNA复制与修复[28-30]。
这4种细胞周期检查点基因(ATR、ATM、RAD17和RAD9)的蛋白序列在龙须菜中的结构域同在酵母和人中的结构域相同，因而属于同源基因。表 2展示了龙须菜这4个基因的拷贝数、染色体定位及其在哺乳动物和酵母中的同源物。由表 2可见，ATR、ATM、RAD17和RAD9分别位于龙须菜的第6、20、10和2号染色体。
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表 2 ATR、ATM、RAD17和RAD9信息 Table 2 ATR, ATM, RAD17 and RAD9 information |
以野生型龙须菜的DNA为模板，对ATR、ATM、RAD17和RAD9的目的片段进行PCR扩增，凝胶电泳检测结果如图 5所示。
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( M：Trans 2K Plus DNA Marker；1—4：ATR各部分序列扩增Each partial sequence of ATR；5—8：ATM各部分序列扩增Each partial sequence of ATM；9：RAD9；10：RAD17 . ) 图 5 龙须菜ATR、ATM、RAD17、RAD9 的PCR扩增电泳结果 Fig. 5 Electrophoresis of PCR amplification results of ATR, ATM, RAD17 and RAD9 in G. lemaneiformis |
由于ATR和ATM片段相对较长，为了确保扩增的精确度和完整性，本研究采用融合PCR法进行扩增，将龙须菜中的ATR和ATM各分为4段扩增，每个片段长度控制在1 700~3 000 bp。RAD9和RAD17的扩增片段长度分别约为1 200和1 800 bp。由图 5可见，4个基因扩增大小均正确。
2.2.2 氨基酸序列分析通过SignaIP-4.1和TMHMM-2.0分别对ATR、ATM、RAD17和RAD9的信号肽和跨膜区进行预测，结果显示这4条蛋白序列均不存在信号肽和跨膜区。利用ExPASy对这4条蛋白序列进行理化性质分析，用不稳定系数和脂肪指数来衡量目的蛋白在体外的稳定性，结果发现，ATR、ATM、RAD17和RAD9为不稳定蛋白(见表 3)。
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表 3 ATR、ATM、RAD17和RAD9蛋白的理化性质 Table 3 Physicochemical properties of ATR, ATM, RAD17 and RAD9 protein |
利用MEGA7.0对19个物种的ATR、ATM、RAD17和RAD9功能结构域氨基酸序列进行多重比对分析。
ATR蛋白序列比对结果如图 6所示。选择ATR蛋白的PIKKc-ATR结构域进行氨基酸多序列比对，该结构域在物种间的序列相似度范围为39.75%~67.39%，龙须菜的ATR序列同酵母和人类的ATR序列相似度分别为40%和43%。由图 6可见，两个关键的保守结构域(Catalytic loop和Activation loop)在所选取的物种中高度保守；而龙须菜ATR中的6个保守氨基酸同酵母和人中ATR的保守氨基酸完全一致。
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( 阴影部分为保守区域；颜色越深代表序列的一致性越高。画横线部分为该基因的保守结构，结构域保守的氨基酸用“▲”表示。The shaded part is the conserved region; the darker color represents the higher sequence identity. The conserved structure of the gene is shown in the horizontal line, and the conserved amino acids in the structural domain are indicated by "▲". ) 图 6 ATR保守结构域序列比对结果 Fig. 6 The sequence alignment of ATR conserved domains |
ATM蛋白序列比对结果如图 7所示，选择ATM蛋白的PIKKc-ATM结构域进行氨基酸多序列比对。该结构域在两个江蓠物种间的序列相似度为100%，龙须菜的ATM序列同芽殖酵母、裂殖酵母和人类的ATM序列相似度分别为44.91%、46.92%和49.32%。由图 7可见，三个关键的保守结构域(ATP binding site、Substrast binding和Activation loop) 在所选取的物种中高度保守，而龙须菜中ATM的3个保守氨基酸同酵母和人中ATM的保守氨基酸完全一致。
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( 阴影部分为保守区域；颜色越深代表序列的一致性越高。画横线部分为该基因的保守结构，结构域保守的氨基酸用“▲”表示。The shaded part is the conserved region; the darker color represents the higher sequence identity. The conserved structure of the gene is shown in the horizontal line, and the conserved amino acids in the structural domain are indicated by "▲". ) 图 7 ATM保守结构域序列比对结果 Fig. 7 The sequence alignment of ATM conserved domains |
RAD17蛋白序列比对结果如图 8所示，选择RAD17蛋白的RAD17/RAD24结构域进行氨基酸序列比对，该结构域在两个江蓠物种间的序列相似度达100%，龙须菜的RAD17同裂殖酵母、芽殖酵母和人类的RAD17序列相似度分别为26.89%、20.24%和25.35%。如图 8所示，龙须菜中RAD17的9个保守氨基酸同酵母和人中RAD17的保守氨基酸完全一致。
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( 阴影部分为保守区域；颜色越深代表序列的一致性越高。画横线部分为该基因的保守结构，结构域保守的氨基酸用“▲”表示。The shaded part is the conserved region; the darker color represents the higher sequence identity. The conserved structure of the gene is shown in the horizontal line, and the conserved amino acids in the structural domain are indicated by "▲". ) 图 8 RAD17结构域序列比对结果 Fig. 8 The sequence alignment of RAD17 conserved domains |
RAD9蛋白序列比对结果如图 9所示，选择RAD9蛋白的RAD9结构域进行氨基酸序列比对，该结构域在两个江蓠物种间的序列相似度为100%，且RAD9蛋白在物种间的保守性并不高，龙须菜的RAD9结构域与芽殖酵母的RAD9相似度很低，同裂殖酵母和人类的RAD9序列相似度分别为19.7%和23.6%。
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( 阴影部分为保守区域；颜色越深代表序列的一致性越高。画横线部分为该基因的保守结构，结构域保守的氨基酸用“▲”表示，相似的氨基酸用“●”表示。The shaded part is the conserved region; the darker color represents the higher sequence identity. The conserved structure of the gene is shown in the horizontal line, and the conserved amino acids in the structural domain are indicated by "▲", similar amino acids are indicated by "●". ) 图 9 RAD9结构域序列比对结果 Fig. 9 The sequence alignment of RAD9 conserved domains |
如图 9所示，黑色三角形和圆点分别标识在19个物种中完全一致和相似的氨基酸残基。其中：缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)的侧链均含有脂肪烃链，属于非极性脂肪族氨基酸；精氨酸(R)和赖氨酸(K)的侧链均含有碱性基团，属于碱性氨基酸。虽然这些氨基酸组成不同，但它们属于同一类氨基酸，氨基酸的侧链结构决定蛋白的功能，同类型氨基酸替代意味着该蛋白质结构和功能的保守性得以维护。
2.2.3 蛋白二级结构预测蛋白二级结构类型主要包括α-螺旋(Alpha helix)、β-折叠(Beta turn)、无规则卷曲(Random coil)与延伸链(Extended strand)。通过SOPMA软件对ATR、ATM、RAD17和RAD9进行二级结构预测，结果如表 4所示：ATR和ATM的4种二级结构所占比例非常相近，都以α-螺旋为主，结构较为紧密；RAD17的二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，α-螺旋占比最高；RAD9的二级结构主要以无规则卷曲为主，其次是α-螺旋，结构较松散。
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表 4 ATR、ATM、RAD17和RAD9蛋白二级结构预测 Table 4 Prediction of secondary structure of ATR, ATM, RAD17 and RAD9 protein |
ATR序列系统进化树如图 10所示，整个进化树结构大致可分为4个主要分支。其中，最大的一支包含了双子叶植物、真藓植物和人的ATR序列，3种红藻的ATR序列单独聚成一支，这表明红藻ATR基因相比其他物种有一定分化，进化树的另外两支分别为芽殖酵母和裂殖酵母的ATR序列。
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图 10 基于ATR氨基酸序列的NJ进化树 Fig. 10 NJ evolutionary tree based on ATR amino acid sequence |
ATM序列系统进化树如图 11所示，整个进化树结构大致可分为4个主要分支。其中，最大的一支包括双子叶植物和哺乳动物的ATM序列，4种红藻的ATM序列单独聚为一支，这表明红藻的ATM与其他物种的ATM有一定的分化，进化树的另外两支分别为芽殖酵母和裂殖酵母的ATM序列。
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图 11 基于ATM氨基酸序列的NJ进化树 Fig. 11 NJ evolutionary tree based on ATM amino acid sequence |
RAD17序列系统进化树如图 12所示，整个进化树结构大致可分为4个主要分支。其中，最大的一支包括鸟纲、爬行纲、硬骨鱼纲物种及人类的RAD17序列，3种红藻的RAD17序列单独聚为一支，表明红藻中的RAD17相比其他物种的RAD17有一定分化，进化树另外两支分别为芽殖酵母和裂殖酵母的RAD17序列。
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图 12 基于RAD17氨基酸序列的NJ进化树 Fig. 12 NJ tree based on RAD17 amino acid sequence |
RAD9序列系统进化树如图 13所示，整个进化树结构大致可分为4个主要分支。其中，龙须菜的RAD9序列同其他两种红藻的RAD9序列聚为一小支，同黄花蒿和阿米巴原虫的RAD9序列聚为一大支。该进化树最大的一支由动物界(脊索动物、节肢动物、环节动物、扁形动物以及软体动物)的RAD9序列组成。芽殖酵母和裂殖酵母的RAD9序列则分别形成了另外两个分支。这说明红藻中的RAD9同人类和酵母的RAD9进化关系较远，与其他物种的RAD9也有一定的分化。
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图 13 基于RAD9氨基酸序列的NJ进化树 Fig. 13 NJ evolutionary tree based on RAD9 amino acid sequence |
本研究经过对龙须菜ATR、ATM、RAD17和RAD9的转录起始位点上游的2 000 bp序列进行顺式作用元件分析，预测了各个基因启动子区的作用元件组成，如表 5所示。这些启动子区作用元件主要有光照响应元件和激素响应元件。这4条基因的转录起始位点上游2 000 bp序列中含有多个核心启动子元件TATA-box和多个顺式作用元件CAAT-box，这些元件对于基因转录的起始至关重要。此外，序列中还包含许多光照响应元件，暗示着这4种基因具有光响应特性。另外还发现有植物激素相关的启动子元件，尤其是茉莉酸甲酯、脱落酸和赤霉素类的顺式作用元件在这4种基因中较为普遍，这些植物激素在植物的细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花、结果、成熟和衰老等生理过程中扮演着重要角色[31-32]。
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表 5 ATR、ATM、RAD17和RAD9启动子序列的顺式调控元件 Table 5 Cis-acting regulatory elements of promoter sequences of ATR, ATM, RAD17 and RAD9 |
构建ATR、ATM、RAD17和RAD9 qPCR扩增片段的标准曲线，这4种基因的扩增效率分别为101.2%、103%、101.7%和98.4%，均接近100%且偏差不超过5%，说明荧光定量引物是可靠的。利用荧光定量PCR对ATR、ATM、RAD17和RAD9 在野生型龙须菜WT、WLP-1品系和良种981中的Ⅰ~Ⅲ时期相对表达量进行定量分析，以野生型龙须菜的Ⅰ期基因表达量为对照，计算其余各品系各个时期的相对表达量，结果如图 14所示。
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( *表示显著增加或减少，且相对表达量大于2或小于0.5。(A) ATR基因表达变化；(B) ATM基因表达变化；(C) RAD17基因表达变化；(D) RAD9 基因表达变化。*indicates significant increase or decrease, and the relative expression quantity was greater than 2 or less than 0.5. (A) Gene expression changes of ATR; (B) Gene expression changes of ATM; (C) Gene expression changes of RAD17 ; (D) Gene expression changes of RAD9 . ) 图 14 G. lemaneiformis不同品系不同发育阶段细胞周期检查点相关基因的相对表达分析 Fig. 14 Relative expression analysis of cell cycle checkpoint related genes in different development stages of different G. lemaneiformis strains |
ATR的定量结果如图 14(A)所示。通过分析同一品系不同发育时期ATR的相对表达量发现，该基因在野生型龙须菜WT和WLP-1品系的Ⅰ~Ⅲ期相对表达量整体呈降低的趋势，在良种981中呈升高的趋势。通过分析同一发育时期不同品系的ATR相对表达量发现：WLP-1品系Ⅰ期相较野生型龙须菜的Ⅰ期，ATR相对表达量虽有增加趋势，但未达到2倍，而良种981的ATR相对表达量甚至无显著的变化；在四分孢子体发育Ⅱ期，WLP-1品系和良种981的ATR相对表达量相较野生型龙须菜的ATR相对表达量均显著增加；在四分孢子体发育Ⅲ期，WLP-1品系的ATR相对表达量无明显变化，而良种981的ATR相对表达量持续显著增加。
ATM的定量结果如图 14(B)所示。通过分析同一品系不同发育时期ATM的相对表达量发现，该基因在野生型龙须菜和WLP-1品系的四分孢子体发育Ⅰ~ Ⅲ期相对表达量整体呈降低的趋势，而在良种981中则呈上升趋势。通过分析同一发育时期不同品系的相对表达量发现：在四分孢子体发育Ⅰ期，WLP-1和良种981的ATM相对表达量与野生型龙须菜的ATM相对表达量相比有上升的趋势；在四分孢子体发育Ⅱ期，WLP-1和良种981的ATM相较于野生型龙须菜的ATM相对表达量显著增加；在四分孢子体发育Ⅲ期，981的相对表达量依然显著增加，WLP-1的表达量无显著变化。
RAD17的表达量如图 14(C)所示。通过分析同一品系不同发育时期的RAD17相对表达量发现：在四分孢子体发育阶段的Ⅰ~Ⅲ期，野生型龙须菜的RAD17 相对表达量无显著变化，WLP-1品系的 RAD17 相对表达量呈降低趋势，良种981的 RAD17 相对表达量呈逐渐上升的趋势。通过分析同一发育时期不同品系的定量发现：在四分孢子体发育Ⅰ期，WLP-1品系的RAD17 相对表达量显著高于野生型龙须菜和良种981的 RAD17 相对表达量；在四分孢子体发育Ⅱ和Ⅲ期，WLP-1品系的 RAD17 相对表达量和野生型龙须菜的 RAD17 相对表达量无显著变化；良种981的 RAD17 相对表达量显著高于野生型龙须菜和WLP-1品系的 RAD17 相对表达量。
RAD9的定量结果如图 14(D)所示。通过分析同一品系不同发育时期的 RAD9 相对表达量结果发现：在四分孢子体发育Ⅰ~Ⅲ期，野生型龙须菜和WLP-1品系的RAD9 相对表达量总体呈降低的趋势；良种981的RAD9 相对表达量均呈上升趋势。通过分析同一发育时期不同品系的定量结果发现：在四分孢子体发育Ⅰ期，与野生型龙须菜相比，WLP-1品系的RAD9 相对表达量显著增加，而良种981的RAD9 基因表达量显著降低；在四分孢子体发育Ⅱ期，与野生型龙须菜相比，WLP-1品系的RAD9 基因表达量呈显著增加的趋势，良种981的RAD9 基因有所增加但变化并不显著；在四分孢子体发育Ⅲ期，WLP-1品系的RAD9 基因表达量呈显著增加的趋势，而良种981则有所降低。
3 讨论龙须菜是中国琼胶产业的主要来源海藻和鲍鱼的重要饵料[33-34]，龙须菜还具有“重金属池”的功能，为全球海藻可持续发展的生物地球化学研究提供了宝贵的样本[35]。在龙须菜的产业中，其产量及质量的优化至关重要，遗传育种的研究作为支持产业发展的关键技术之一，显得尤为重要。四分孢子囊数量以及四分孢子放散量是衡量四分孢子体育性的关键指标，良种981以其低育性的特征和较低的藻体表面损伤率成为龙须菜养殖产业中的重要品种优势。研究龙须菜育性调控基因，探究其表达控制机理，可以为实现龙须菜育性调控及新品种的培育奠定基础。
细胞周期检查点是确保细胞周期以高保真性和有序的方式完成调节的途径[36-38]。酵母是研究细胞周期检查点通路的模式生物，在人类及其他的哺乳动物中也已有研究[39]。检查点在进化上具有保守性，裂殖酵母和芽殖酵母检查点基因同人类的检查点基因相比，存在更多的同源基因，已有研究报道指出，芽殖酵母和裂殖酵母中存在人类细胞周期检查点基因的同源物[40-44]。龙须菜中的ATR、ATM、RAD1和RAD9 同人类和酵母中的同源基因具有一致的注释，因此本研究选择这4种基因作为研究基因。通过基因分离及特征分析找到龙须菜中的细胞周期检查点基因。通过分析功能结构域发现，龙须菜中的ATR、ATM、RAD17和RAD9同芽殖酵母、裂殖酵母及人类的同源基因拥有相同的结构域，属于同一基因家族；通过进化树分析发现，龙须菜中的ATM、ATR、RAD17和RAD9与其他物种相比有一定的分化。通过基因克隆得到了ATR、ATM、RAD17和RAD9，证明它们在龙须菜中确实存在。这4种基因在该通路中作为感受器，当DNA损伤或复制受阻时，感受器感知损伤将信号并传递给下游的信号分子。这4种基因具体功能还需后续工作验证。
在酵母和人的细胞周期检查点通路中，ATR和ATM是两种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(300~500 kDa)[45]，二者在细胞周期阻滞、细胞凋亡、DNA损伤修复和染色质重塑等方面发挥重要作用[46-48]。ATR和ATM分别负责启动DNA单、双链损伤修复，当发生DNA单链损伤时，复制蛋白A(RPA)会迅速包裹到裸露的单链DNA上，9-1-1复合体作为“检查点钳”在RAD17-RFC钳加载复合物的协助下结合到DNA链损伤处，同时招募和激活ATR/ATRIP复合物，激活的ATR/ATRIP复合物会通过磷酸化下游效应激酶(即细胞周期检查点激酶CHK1和CHK2)来传递信号，CHK1和CHK2又通过调节控制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复合物的活性来阻止细胞周期[10-11, 19]。RAD9最主要的功能是参与DNA损伤的修复和细胞周期检查点的调控[49]，维持基因组稳定、选择性地调节下游靶基因的转录、影响核苷酸合成、诱导细胞凋亡和胚胎发育等[49-50]。当DNA发生损伤时，细胞可通过细胞周期检查点来发现这些损伤，而RAD9可作为一个早期损伤感受因子探测DNA损伤[51-52], 同HUS1和RAD1形成一个9-1-1复合物[52]。RAD17与4个小亚基组成一个异源五聚体RAD17-RFC，作为响应DNA损伤修复的钳加载器(Clamp loader)参与细胞周期检查点通路[48, 53]。植物中，由于缺乏CHK1和CHK2的同源物，它们则通过另一类蛋白激酶SOG1[54-56]或WEE1[57-58]，控制通过磷酸化周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)的第15位酪氨酸CDK的活性，从而实现对细胞周期的调控。龙须菜细胞周期检查点完整的通路组分还需在后续研究中进一步探究。
基因的启动子作为上游调控因子识别并结合的部位在基因表达调控中发挥着重要作用。植物启动子包括核心元件和一般上游元件。研究表明，ATR、ATM、RAD17和RAD9基因的上游均含有TATA-box和CAAT-box。TATA-box是RNA聚合酶Ⅱ的识别位点，也是一些反式作用因子与DNA相互作用的位点之一，能决定转录起始位点，并指导起始前复合物的形成；CAAT-box，能够决定转录起始频率和转录强度，可以激活正、反转录方向，与顺式调控元件协同作用[59-61]。除此之外，这4个基因的上游序列中还含有多种响应元件，它们对光照、植物激素等环境因素具有敏感性。其中，光照相关作用元件、植物激素相关作用元件以及其它作用元件的存在，意味着这些4个基因的表达共同受到光照、茉莉酸甲酯和脱落酸等多重因素的影响。激素诱导启动子在整个植物生命周期中发挥作用，调控细胞周期[62]，它不仅涉及植物从萌发到成熟的过程，还与细胞水平的分裂分化息息相关。众所周知，脱落酸不仅是影响种子萌发以及胚胎发育和叶片衰老的植物激素，还在非生物胁迫和生物胁迫中均发挥作用。有研究报道，脱落酸能够抑制植物细胞分裂，通过抑制细胞DNA合成和阻止细胞从G2期进入细胞分裂期来影响植物细胞周期。茉莉酸甲酯(MeJA)是一种新型植物激素，在植物对生物性和非生物性逆境胁迫的响应以及生长发育的基因调控中发挥着重要作用[63-64]。它能诱导植物防御基因的表达，调控植物对机械伤害、盐害及紫外线照射等非生物胁迫的反应[65]。本研究所选取的4个基因中存在茉莉酸甲酯和脱落酸启动子顺式作用元件，这些不同类型响应元件的存在揭示了龙须菜的细胞周期调控的复杂性和多样性。
良种981在四分孢子体发育阶段异于野生型龙须菜和WLP-1品系。WLP-1是本实验室选育出的耐高温的低磷速生品系[66]，其四分孢子体发育特点与良种981恰好相反，表现出容易成熟且高育的特点。通过对不同品系间Ⅰ期的ATR、ATM、RAD17和RAD9进行荧光定量分析发现，这4个基因表达量在WLP-1品系中呈现上升趋势，尤其是RAD17和RAD9，而这4个基因表达量在良种981中无显著的变化，RAD9甚至出现显著降低的趋势。这一结果表明，WLP-1品系在四分孢子体发育的Ⅰ期就存在相对活跃的DNA复制过程，细胞分裂旺盛。同时，细胞周期检查点基因对复制过程中出现的问题及时进行了检验及修复，确保了四分孢子的快速而正确的形成，并进入成熟阶段。这种高效的复制与分裂机制可能是WLP-1品系高育性的关键所在，并与其在四分孢子发育时期孢子放散速度较快的现象相呼应。进一步分析不同品系四分孢子体发育Ⅱ~Ⅲ期的基因相对表达发现，野生型龙须菜中这4种基因相对表达量虽有所下降，但整体趋势并不显著，表达量保持相对平稳。在WLP-1品系的四分孢子体发育Ⅱ期中，RAD17的相对表达量有上升趋势，ATR、ATM和RAD9 的相对表达量均表现出现显著上升的趋势，推测在WLP-1品系这一时期DNA复制起始活跃，细胞分裂速度加快，从而加速了四分孢子的形成与成熟。为了保证遗传物质能准确遗传给下一代，细胞周期检查点对复制与分裂过程进行了严格的检验与修复。在WLP-1品系的四分孢子体发育Ⅲ期中，ATR、ATM、RAD17和RAD9的基因表达量同Ⅰ和Ⅱ期相比出现下调，但同野生型龙须菜的Ⅲ期相比，ATR、ATM和 RAD17 基因表达量无显著变化，这表明四分孢子进入成熟期，与细胞周期相关的基因活动减弱，检查点基因表达量也逐渐降低，周期活动趋于稳定。
良种981中，ATR、ATM和RAD17基因相对表达量在四分孢子体发育的Ⅱ和Ⅲ期分别相较于野生型的Ⅱ和Ⅲ期呈现显著上升的趋势，而在Ⅰ期，这些基因无显著变化。细胞周期检查点基因在Ⅱ期变得活跃说明在这一时期良种981的DNA复制可能出现了问题，从而促使细胞对其进行检测及修复，因而推测其DNA损伤修复相关通路被激活。RAD9 虽在良种981的Ⅰ期表达量极低，但良种981在Ⅱ期表达上调。ATR、ATM、RAD17和RAD9共同感知放散过程中产生的DNA损伤，为了将遗传物质精准的复制并遗传给下一代，它们会协同作用，触发一系列反应以阻滞细胞周期的进程，为DNA修复提供充足的时间，待损伤修复完成后，它们会重新启动细胞周期进程。当机体发现DNA损伤极其严重时，DNA损伤的细胞即走向细胞程序性死亡[67-68]。通过镜检发现，良种981在四分孢子体放散过程中，四分孢子囊不能完成2次分裂以形成4个原始的四分孢子。这些细胞发生变形，一部分游离出的四分孢子囊伴随着色素的消失发生细胞破裂而内容物溶出，另外一部分释放出的四分孢子迅速发生破裂溶解，特别是在Ⅱ~Ⅲ期，四分孢子出现畸形和破损[5]。基于这些观察，从而推测出在良种981产生四分孢子阶段(Ⅱ期)，DNA损伤并未完全修复，导致畸形的四分孢子走向程序性死亡，这可能是造成“981”龙须菜低育的一个原因。
4 结语本研究首次揭示了大型红藻中细胞周期检查事件相关的基因及其调控，为阐明红藻DNA复制和修复机制提供了基础数据。
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