霍乱弧菌(Vibrio cholerae, V. cholerae)属于弧菌科弧菌属，为一种存在于自然界淡水和海水水体中的环境微生物^[1]。该菌革兰阴性，呈杆状或弯曲状，兼性厌氧，在血平板上形成的菌落呈灰色，有周生鞭毛及动力。易感人群饮用霍乱弧菌污染的淡水，或摄食受污染的贝类或其他海产品时可引起感染。大多数感染无症状^[2]，少数引发肠道和肠道外疾病，临床表现多为霍乱，有胃肠炎、恶心、呕吐、腹泻、腹痛、低热、畏寒等全身症状。

霍乱弧菌有200多个血清群，包括O1群、O139群和非O1非O139群。O1群菌株染色体ctxAB编码的霍乱肠毒素是最重要的毒力因子，可导致肠道分泌大量水和电解质，是引起烈性肠道传染病霍乱的重要原因。霍乱属于甲类传染病，严重者伴有特征性“米泔水”样暴发性腹泻，导致体液丢失和严重脱水。自1817年起，全球范围共发生7次霍乱大流行，造成大规模人群感染和伤亡。携带表面抗原O1或O139的菌株通常产生霍乱肠毒素，而非O1非O139群霍乱弧菌(non-O1, non-O139 V. cholerae, NOVC；也可简称为非O1群)不产生该肠毒素，不引发霍乱，导致的胃肠道感染症状比霍乱轻^[3]。近年来，NOVC引发肠道外感染和血流感染的报道^[4-6]日益增多，应提高NOVC对人体健康潜在危害的认识。本研究对2022年度某院患者血培养标本分离的两株NOVC进行微生物学和患者临床特征分析，为霍乱弧菌相关血流感染提供诊断依据，规范临床对霍乱弧菌感染的防控措施。

1 对象与方法 1.1 细菌分离培养

患者阳性血培养标本，根据微生物检验操作流程直接涂片进行革兰染色镜检，并接种于羊血、麦康凯琼脂培养基(郑州安图生物)，孵箱35℃过夜培养，筛选可疑病原菌进行初步鉴定。

1.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定

根据MALDI-TOF MS检测操作规程，将涂布待测菌株的靶板装载入Vitek MS质谱仪(法国Biomerieux)进行鉴定，获得待测菌的鉴定结果。

1.3 显色培养基鉴定

分离菌初步鉴定结果为弧菌属，将菌落分离至VIB弧菌显色培养基(法国Chromagar)，同时将霍乱弧菌质评菌株传代至显色培养基作为对照，35℃过夜培养。

1.4 生化鉴定

使用API 20E和20NE鉴定卡(法国Biomerieux)检测分离菌的生化反应特性，并使用VITEK 2 Compact微生物鉴定药敏仪配套的GN鉴定卡(法国Biomerieux)进行细菌鉴定。

1.5 血清学凝集试验

使用O1群、O139群霍乱弧菌诊断血清(宁波天润生物)分别对菌株进行玻片法血清学凝集试验，以生理盐水作为阴性对照。

1.6 16S rRNA基因测序

提取细菌基因组，聚合酶链式反应(PCR)、产物纯化及测序均由擎科生物科技有限公司完成，并进行Blast比对分析。

1.7 ctxAB PCR检测

按照霍乱弧菌CTXAB核酸检测试剂盒(深圳生科原生物)说明，针对ctxAB毒力基因的TaqMan探针进行实时荧光检测。

1.8 药敏试验

采用E-test法药敏试验，检测菌株对氨苄西林、阿奇霉素、多西环素、四环素、复方磺胺甲唑和氯霉素的敏感性，依据2015年美国临床实验室标准化协会(CLSI)不常见或苛养菌药敏试验M45-3rd弧菌属-霍乱弧菌标准进行判断。

2 结果 2.1 病例资料

患者1，女性，92岁，因“间断头昏15年，加重1个月余”于2022年8月入该院老年病科住院治疗。患者既往有高血压病史7年，曾进行膀胱恶性肿瘤绿激光治疗和化学治疗，有反流性食管炎、骨质疏松和动脉粥样硬化等基础疾病。住院期间食用家属外带食物后自觉腹部胀痛，进食后加重伴食欲不振，随后出现发热，体温最高38.6℃，伴有寒战，物理降温后维持在38℃，精神不佳，无腹泻。急查血常规白细胞计数16.23×10⁹/L，中性粒细胞百分比82.7%，C反应蛋白106 mg/L，白细胞介素698.41 pg/mL，降钙素原1.12 ng/mL，血清淀粉样蛋白A 1 200 mg/L，血培养提示“查见革兰阴性杆菌”。根据患者发热、血培养阳性和炎症指标升高，考虑“败血症”，给予比阿培南经验性抗感染治疗，并适当补液、调整血压和通便治疗。抗感染治疗3 d后，患者精神和食欲逐渐好转，体温正常，停用抗菌药物。血培养回报“NOVC”。

患者2，女性，84岁，因“腹痛伴发热12 h”于2022年9月入该院急诊科就诊。患者既往因胆囊结石进行胆囊切除术，因“肝内胆管结石、肝脓肿”进行肝左叶切除术，并进行胃部分切除术(原因不详)，有2型糖尿病等基础疾病。患者无明显诱因出现腹痛，以上腹部疼痛为主，发热，体温最高39.2℃，伴有寒战，有恶心、呕吐、气短，无腹泻和尿路刺激征，急诊以“发热待查，急性胆管炎待排，急性胰腺炎待排，2型糖尿病”收入院。血常规白细胞计数5.49×10⁹/L，中性粒细胞百分比72.1%，淋巴细胞百分比14.9%，红细胞计数2.77×10¹²/L，血红蛋白86 g/L，C反应蛋白77.9 mg/L，白细胞介素6 231.9 pg/mL，降钙素原0.499 ng/mL，丙氨酸转氨酶(ALT)98 IU/L，天冬氨酸转氨酶(AST)120 IU/L，γ-谷氨酰基转移酶264 IU/L，血清淀粉酶、脂肪酶正常，血培养提示“查见革兰阴性杆菌”。根据患者发热、血培养阳性和炎症指标升高，给予比阿培南抗感染和对症支持治疗。患者体温逐渐恢复正常，神志清，精神差，家属拒绝在院继续治疗，患者出院居家观察。血培养回报“NOVC”。

2.2 血培养细菌分离情况

患者1送检的需氧血培养瓶报警时间为10 h 4 min，厌氧培养瓶报警时间为8 h 44 min；患者2送检的需氧血培养瓶报警时间为9 h 19 min，厌氧培养瓶报警时间为8 h 28 min；四瓶阳性标本直接涂片革兰染色结果均为革兰阴性微弯曲状杆菌。标本接种血琼脂平板培养18 h可形成具有透明β溶血环的暗灰色菌落，麦康凯琼脂平板上形成透明菌落，单个菌落经革兰染色，镜下所见为革兰阴性杆状或弯曲状弧菌。培养菌落分散到生理盐水中制成菌悬液，压滴法观察动力(+)。分离菌传代至弧菌显色培养基，生长形成的菌落呈蓝绿色至绿松石蓝色，与对照菌株霍乱弧菌(质评菌株)的菌落颜色一致。见图 1A~C。

2.3 细菌鉴定

两株分离菌经VITEK MS鉴定为霍乱弧菌(V. cholerae)，可信度均为99.9%；经API 20E、API 20NE鉴定卡均鉴定为霍乱弧菌，鉴定率分别为99.9%、99.3%(20E卡)及99.0%、99.4% (20NE卡)，见图 1D；经VITEK GN卡鉴定为霍乱弧菌，鉴定率分别为98%、97%，生物编码分别为0425601151506221、0425601151507231。提取菌株DNA，PCR扩增16S rRNA并测序，应用BLAST软件将所测序列与GenBank数据库中的序列比对，进行同源性分析。结果显示两株菌16S rRNA基因与GenBank收录的霍乱弧菌V. cholerae strain W10G chromosome 1. complete sequence(序列ID号为CP 053794.1)相似性均为100%，鉴定为霍乱弧菌。

2.4 生化反应特性

分离菌可在氯化钠浓度为0、1%和6%的蛋白胨水中生长，分解葡萄糖、甘露醇和蔗糖，具有葡萄糖、甘露醇、乙酰基葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸、苹果酸和枸橼酸同化能力。硝酸盐还原(NO₃)试验、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)试验、赖氨酸脱羧酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验、对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)试验、氧化酶试验、乙酰甲基甲醇(Voges-Proskauer, VP)试验、明胶水解试验、吲哚试验、动力试验均阳性；精氨酸双水解酶试验、色氨酸脱羧酶试验、七叶苷水解试验和脲酶试验均阴性；不产生硫化氢，不分解肌醇、山梨醇、鼠李糖、蜜二糖、苦杏仁苷和阿拉伯糖，不同化阿拉伯糖、甘露糖、葵酸、已二酸和苯乙酸。

2.5 血清学分型和毒力特征

分离菌株O1群霍乱弧菌血清凝集试验、O139群霍乱弧菌血清凝集试验均阴性，排除O1、O139群霍乱弧菌，确定为NOVC。同时，荧光PCR法检测霍乱弧菌毒力基因ctxAB阴性。

2.6 耐药表型特征

分离菌株对6种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)和药敏试验结果见表 1。所有菌株对氨苄西林、阿奇霉素、多西环素和氯霉素均敏感；患者1分离株对四环素、复方磺胺甲唑敏感，患者2分离株对上述两种药物耐药。

2.7 患者临床特征和感染防控措施

2例患者均为老年女性，年龄84、92岁，有基础疾病多年，1例患者肝功能异常。两例患者均在夏秋季节发病，该季节正是肠道传染病和弧菌感染的高发季节，首发症状均为发热伴腹部不适，无腹泻症状，无先泻后吐和米泔样水便等霍乱典型的临床表现。患者分离菌经质谱鉴定和复核后，检验科微生物室及时向临床科室报告，并详细解释病原体名称NOVC及其致病意义，强调了此病原体不属于引起甲类传染病霍乱的O1或O139血清型霍乱弧菌，无需进行疫情上报，注意采取及时准确地抗感染治疗，监测患者生命体征和症状变化，如出现腹泻及时送检粪便(弧菌)培养。同时联系医院感染控制科通报患者病原学情况，积极加强患者教育和医护人员手卫生宣传，完成病房清洁消毒，避免医院感染发生。

3 讨论

文献显示，NOVC感染病例多见于有基础疾病和免疫力低下的人群，包括慢性肝脏疾病(肝硬化)^[7-8]、血液病^[9]、肿瘤患者，偶见于免疫功能正常的健康人群^[10]，临床表现多为肠道外感染，以血流感染为主，如菌血症和败血症^[4-6]，其他感染类型包括皮肤创口、软组织(脓肿、坏死性筋膜炎、蜂窝织炎)、耳部^[11]感染等。需要注意的是，慢性肝病可能是NOVC系统性感染最主要的易感因素之一，有关这类群体NOVC传播并导致血流感染的具体致病机制和途径仍然不明确。本研究患者临床特征包括高龄，基础疾病多，免疫功能降低，临床表现均有发热、胃肠道不适的首发症状，无腹泻，无霍乱典型的临床表现。患者发病前可能摄入霍乱弧菌污染的食物，细菌通过消化系统侵入血液，加之患者免疫力较低，造成血流感染，这与患者血培养阳性，炎症反应标志物升高相符；两例患者均未采集粪便进行霍乱弧菌培养。

霍乱弧菌不属于人体正常微生物，属于环境微生物，一旦从人体标本分离出霍乱弧菌应视为传染性病原体。根据国家卫健委2023年发布的《人间传染的病原微生物目录》要求，霍乱弧菌的标本检测、活菌操作等可在生物安全二级的临床微生物实验室内进行。自临床标本分离的疑似霍乱弧菌，实验室在报告时应选择多种方法确保菌种鉴定正确，如MALDI-TOF MS、全自动微生物鉴定仪和16S rRNA测序。不具备以上鉴定条件的实验室，可使用商品化细菌生化反应鉴定卡(如API卡，需注意个别弧菌属需调整培养基或悬浮液的NaCl浓度以促进其生长)。鉴于O1群、O139群菌株具有强烈致病性和传染性，实验室必须具备快速分型能力，如霍乱弧菌诊断血清或分子生物学方法(ctxAB PCR检测)。血清凝集试验可快速确定其血清学型别，区分O1群、O139群和非O1非O139群，同时参考患者临床症状，做好临床沟通和必要的疫情上报。一旦确定为O1群或O139群，应及时上报医院感染监控部门并完善霍乱疫情直报，采取有力的感染控制措施，做好病区隔离、消毒工作，阻断疫情传播扩散。对于NOVC，根据患者症状采取适度的感染控制隔离及必要的监测、治疗措施，避免疫情误报，造成过度处置和医疗资源的浪费。本研究两株NOVC分离自不同时期不同科室的患者，后期也未在其他患者中分离到该致病菌，且耐药表型存在差异，理论上不具有同源性，可初步排除医院内传播的可能性，如有必要可以通过菌株多位点序列分型(MLST)或全基因组测序进行甄别。

霍乱弧菌药敏试验应依据美国CLSI M45弧菌属-霍乱弧菌标准进行检测，应报告菌株对氨苄西林、阿奇霉素、多西环素、四环素、复方磺胺甲唑和氯霉素六种抗菌药物的敏感性结果，可参考Laviad-Shitrit等^[12]的研究。国内大部分文献^{[6, 8]}报告其对哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星等的敏感性，参照的是M45文件弧菌属标准，不具有规范性。霍乱弧菌药敏试验报告的正规化和标准化需要临床微生物检验和疾病预防控制人员重视。目前关于霍乱弧菌所致血流感染的治疗经验甚少，通常给予全身性静脉抗菌药物治疗。本研究两例患者都经验性应用比阿培南静脉滴注抗感染治疗，发热和全身症状有所改善，炎症指标恢复正常，治疗有效。

综上所述，霍乱弧菌所致的胃肠外感染报道罕见，特别是NOVC所致的血流感染在我国少有报道，加之个别实验室检验能力不足，给该疾病的诊断带来一定难度。本研究有助于开拓临床医生和微生物检验人员的诊断思路，建议血流感染疑似患者尽早送检血培养以明确病原体；特别是对从免疫力低下患者血培养标本中分离的霍乱弧菌，应在保证菌种鉴定结果准确的前提下，进行血清学分型区分O1群、O139群和NOVC，正确按照传染病分类上报和防控；根据标准报告分离株药敏结果，尽快给予目标性抗感染治疗，挽救患者生命。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。