2. 伊犁州友谊医院重症医学一科, 新疆 伊犁哈萨克自治州 835000;
3. 广东省中国人民解放军南部战区总医院重症医学科, 广东 广州 440104
2. Department of Critical Care MedicineⅠ, Yili Friendship Hospital, Ili Kazak Autonomous Prefecture 835000, China;
3. Department of Critical Care Medicine, Southern Theater Command General Hospital of PLA, Guangzhou 440104, China
急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)是脓毒症严重的并发症之一，脓毒症患者发生AKI的概率约20%，当脓毒症患者发生休克时合并AKI的概率高达51%，死亡风险也会继之加大[1-2]。铁死亡是一种依赖铁和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的新型程序性细胞死亡形式[3]。在脓毒症相关AKI中，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的AKI会引起铁代谢紊乱、ROS和脂质过氧化物的增多[4-5]。Kim等[6]研究发现，在肾小管上皮细胞损伤中发生铁死亡，溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)显著降低，抑制铁死亡可有效减轻肾损伤。因此，铁死亡可能参与调控AKI后肾小管上皮细胞(human kidney-2, HK-2细胞)死亡，在脓毒症所致的AKI中扮演着重要的角色。
穿心莲内酯(andrographolide, AG)是一种天然的二萜内酯类化合物，其在抗炎、抗氧化、抗癌、免疫调节等方面发挥着重要作用[7]。在对脓毒症小鼠的研究中，AG可通过调节多个信号通路减轻炎症反应及肝肺损伤，提高实验性脓毒症小鼠的存活率[8]。Liu等[9]研究发现，AG还可以减少肾小管上皮细胞的凋亡和纤维化，对肾小管上皮细胞起一定的保护作用。然而，AG对脓毒症所致AKI的保护作用，是否与铁死亡机制有一定的联系，目前国内外仍未有相关研究。因此，本研究采用LPS诱导的HK-2细胞脓毒症损伤模型，探讨AG抑制铁死亡的有效性以及可能的作用机制。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 细胞与试剂HK-2细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：CL-0109)；AG(美国Sigma公司，批号：365645)；LPS(北京索莱宝科技有限公司，批号：L8880)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒、还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号分别为BC0025、BC1175)；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)、肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1, KIM-1)ELISA检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司，批号分别为EK1116、EK1118)；CCK-8细胞活力检测试剂盒(上海东仁化学科技有限公司，批号：CK04)；胎牛血清(美国Gibcog公司，批号：C0232)；DMEM培养基(美国Gibcog公司，批号：8122691)；胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索莱宝科技有限公司，批号：T1320)；二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO，北京索莱宝科技有限公司，货号：D8370)；DHE染色试剂盒(苏州宇恒生物技术公司，批号：D1008)；SLC7A11、GPX4、Ferritin抗体(上海Abmart医药科技有限公司，批号分别为T57046、T56959、T55648)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗、β-actin单克隆抗体(北京中山金桥生物科技有限公司，批号分别为TA130003、TA328071)。
1.1.2 试验仪器二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；光学显微镜(日本HIRAYAMA公司)；双稳定时电泳仪电源(北京六一科技有限公司)；四版转印/转膜电泳槽(北京六一科技有限公司)；紫外分光光度计(美国Thermo公司)；凝胶成像仪(上海天能公司)。
1.2 试验方法 1.2.1 细胞培养与分组HK-2细胞采用含有10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM培养基在含5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。细胞70%~80%融合时，按照1∶4比例转移细胞至新的培养瓶培养，换液频率为每周2~3次。将细胞分为4组，对照组(Control)、LPS组(用10 μg/mL LPS处理22 h构建脓毒症细胞模型[10])、LPS+DMSO组(DMSO作为AG的溶液，排除DMSO对细胞的影响)、AG组(10 μmol/L AG预处理细胞1 h)。
1.2.2 CCK-8检测细胞的活性将各组细胞以每孔3×104个细胞的密度接种96孔板，贴壁后每孔中加入10 μL CCK-8溶液，培养箱继续孵育2 h后，酶标仪分析450 nm处各孔光密度(OD)值。
1.2.3 NGAL和KIM-1的测定收集各组HK-2细胞中的上清液，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肾损伤标志物NGAL和KIM-1的水平。将100 μL标准品或样品一式三份加入到微孔板中，再加入50 μL稀释的检测抗体，在室温下孵育2 h。随后，加入100 μL稀释后的链霉亲和素HRP，孵育45 min。再加入100 μL底物溶液，20 min，避光。最后，使用微孔板读取器在450、630 nm处读取吸光度。
1.2.4 MDA、GSH的测定收集各组细胞至离心管内，弃去细胞培养液，加入提取液超声破碎细胞，离心收集上清液后置于冰上。按照MDA含量、GSH活性检测试剂盒步骤测定各组HK-2细胞中MDA含量及GSH活性。
1.2.5 ROS测定使用二氢乙锭(dihydroethidium, DHE)作为探针评估细胞ROS水平。将HK-2细胞接种于6孔板中，与6 μmol DHE孵育30 min，然后用2 mL磷酸盐缓冲液洗涤3次。用荧光显微镜拍摄细胞的所有荧光图像，所有图像拍摄倍数×200。
1.2.6 Western blot用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的冰冷RIPA裂解缓冲液提取蛋白后进行配平，100℃煮沸10 min，分装放-80℃冰箱中保存备用。配制分离胶和浓缩胶后，在每孔中加入10 μL蛋白，首先分别用80、120 V恒压电泳，接着用200 mA恒流“三明治”法转膜，封闭2 h，孵一抗和二抗后进行曝光，采用Image J定量分析蛋白灰度值。
1.3 统计学方法应用SPSS 26.0软件进行统计分析。试验结果采用x±s描述；两组数据比较采用t检验，多组间的比较采用方差分析，以P≤0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 AG对LPS诱导的HK-2细胞的影响分别用1、5、10、20、40 μg/mL的LPS处理细胞22 h，与Control组相比，随着LPS浓度的增加，细胞活力逐渐下降，在10 μg/mL时活力下降最为明显(P＜0.05)，故选用10 μg/mL浓度的LPS构建脓毒症细胞损伤模型，见图 1A。分别用DMSO和不同浓度的AG(5、10、20、40 μmol/L)干预HK-2细胞12 h，与Control组相比，以上浓度AG干预后细胞活力比较，差异无统计学意义(均P＞0.05)，表明DMSO作为AG的溶剂对细胞无损害作用，且5~40 μmol/L AG单纯干预对HK-2细胞活力无明显影响，见图 1B。为研究AG是否对LPS诱导的HK-2细胞损伤具有保护作用，进一步采用5、10、20 μmol/L AG联合LPS处理细胞24 h，与LPS组相比，5、10、20 μmol/L AG处理的HK-2细胞存活率均有不同程度的升高(均P＜0.05)，且10 μmol/L AG处理的HK-2细胞存活率升高较为明显(P＜0.05)，见图 1C。因此，以下试验选用10 μmol/L AG进行干预。
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| 注：A为不同浓度LPS处理HK-2细胞对细胞活力的影响；B为不同浓度AG处理HK-2细胞对细胞活力的影响；C为不同浓度LPS和AG处理HK-2细胞对细胞活力的影响；D为各组细胞中NGAL水平；E为各组细胞中KIM-1水平；*表示与Control组比较，P＜0.05；#表示与LPS组比较，P＜0.05。 图 1 LPS和AG对细胞活力的影响 Figure 1 Effect of LPS and AG on cell viability |
对肾损伤标志物进行检测，与Control组相比，在LPS组中，NGAL和KIM-1水平升高(P＜0.05)，而AG组较LPS组降低，见图 1D、1E，因此，AG在一定程度上可减轻脓毒症所致的HK-2细胞损伤。
2.2 AG对HK-2细胞形态结构的影响光镜观察细胞形态，Control组HK-2细胞形态呈圆形铺路石样，细胞生长状态良好；与Control组相比，LPS组的HK-2细胞变形呈梭形，轮廓模糊，贴壁能力下降；与LPS组相比，AG组细胞状态有明显改善，与Control组细胞形态基本相似，见图 2。
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| 注：A为Control组；B为LPS组；C为LPS+DMSO组；D为AG组。 图 2 光镜下观察不同处理组HK-2细胞形态(100×) Figure 2 HK-2 cell morphology of different treatment groups observed under light microscope (100×) |
检测各组的氧化应激指标，与LPS组相比，AG组中MDA含量均降低(P＜0.05)，见图 3A，GSH水平也显著升高(P＜0.05)，见图 3B；AG组较LPS组，Fe2+含量明显减低(P＜0.05)，见图 3C，说明AG可有效降低HK-2细胞的铁代谢障碍；ROS荧光结果显示，与Control组相比，LPS组荧光强度增强，而AG组相比于LPS组荧光强度有明显减弱，见图 3D。表明AG可降低细胞内MDA和ROS的含量，提高GSH含量，减少胞内的脂质过氧化和铁死亡。
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| 注：A为各组细胞中MDA水平；B为各组细胞中GSH水平；C为各组细胞中Fe2+水平；D为各组细胞中ROS水平；*表示与Control组比较，P＜0.05；#表示与LPS组比较，P＜0.05。 图 3 HK-2细胞内MDA、GSH含量及ROS荧光强度 Figure 3 Contents of MDA and GSH in HK-2 cells and ROS fluorescence intensity |
进一步进行Xc-系统关键蛋白SLC7A11、GPX4表达水平的检测，结果发现，与Control组相比，LPS组SLC7A11、GPX4蛋白水平降低，Ferritin蛋白水平升高(均P＜0.05)；经AG处理后，SLC7A11和GPX4蛋白水平升高，Ferritin蛋白水平表达降低(均P＜0.05)，见图 4。表明AG通过SLC7A11/GPX4通路上调Xc-系统活性，降低Ferritin蛋白的表达，减轻胞内铁死亡的发生。
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| 注：*表示与Control组比较，P＜0.05；#表示与LPS组比较，P＜0.05。 图 4 HK-2细胞中SLC7A11、GPX4、Ferritin蛋白表达情况 Figure 4 Expression of SLC7A11, GPX4 and ferritin protein in HK-2 cells |
脓毒症急性肾损伤是指原未患有肾脏疾病的患者，在发生脓毒症后出现了血、尿、组织学及影像学可见的肾脏结构或功能的障碍[1]。脓毒症并发肾损伤时，集束治疗效果不明显，患者预后不佳，因此迫切需要了解其发病机制及治疗靶点[11-12]。本研究采用LPS诱导HK-2细胞建立脓毒症损伤模型，细胞存活率下降，且肾细胞损伤加重，而给予AG干预后，细胞存活率有所恢复，肾细胞损伤减轻，表明AG对脓毒症HK-2细胞具有保护作用。
AG具有强大的抗氧化作用，在心血管疾病、肾脏疾病、癌症等人类主要疾病方面发挥治疗作用[13-14]。相关研究[15]报道，AG可增加脓毒症小鼠腹腔中巨噬细胞的百分比和吞噬活性，降低促炎因子水平，增强细菌清除率来提高小鼠的存活率。Lee等[16]研究表明，AG通过抑制HMGB1信号通路减轻炎症反应，治疗脓毒症所致的血管炎性反应。另有研究[17]表明AG在肾脏疾病方面具有保护作用，AG可通过Akt/NF-kB通路减轻高血糖介导的肾脏氧化应激和炎症，从而改善肾功能障碍。本研究发现AG对脓毒症HK-2细胞具有保护作用，肾损伤标志物NGAL和KIM-1显著减低，并且能够逆转LPS干预下的HK-2细胞铁死亡的特征，包括降低MDA、ROS水平以及Fe2+含量，下调Ferritin蛋白表达水平，提高GSH含量，因此AG可能抑制HK-2细胞的铁死亡。
铁死亡是近年来发现的新的细胞死亡机制，研究[18-19]表明，其参与了不同形式的肾损伤进展。本研究发现AG可调控铁死亡，铁死亡相关靶点可能成为改善肾损伤的调节机制之一。Xc-系统和GPX4是调节铁死亡的主要成分。Xc-系统是由SLC7A11和溶质载体家族3成员2(solute carrier family 3 member 2, SLC3A2)组成的胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白，可将细胞外的胱氨酸与细胞内的谷氨酸1∶1进行交换，为GSH的合成提供底物[20]。GSH是体内重要的抗氧化剂，也是合成GPX4的重要因子[21]。Xc-系统中的SLC7A11与下游的GPX4形成对抗铁死亡的主要抗氧化屏障，激活Xc-系统，将增加GSH的合成，进而促进与GPX4的协同作用，有效清除活性氧ROS，减少脂质过氧化物的产生，抑制铁死亡[22]。本研究发现，LPS损伤后的HK-2细胞中SLC7A11、GPX4蛋白表达降低，Ferritin蛋白水平增加，抗氧化物GSH含量显著减少，故细胞内的抗氧化系统已遭到破坏，从而导致细胞内Fe2+含量、活性氧ROS以及脂质过氧化产物MDA大量增加。给予AG后，上调GSH、铁死亡标志蛋白SLC7A11、GPX4表达，下调Fe2+含量、Ferritin蛋白、活性氧ROS、脂质过氧化物MDA的表达。因此，抑制铁死亡可能改善脓毒症肾损伤。
综上所述，本研究发现，AG可以激活HK-2细胞中的SLC7A11/GPX4通路，减少氧化应激，上调抗氧化酶活性，减轻LPS诱导的细胞铁死亡，从而减轻细胞损伤，提高存活率。然而，铁死亡在脓毒症肾损伤中是多种因素参与的复杂过程，AG是否可以通过其他途径抑制铁死亡，是否参与了其他死亡形式的调节，仍需进一步的探讨和研究。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。
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