2. 四川省遂宁市第一人民医院儿科, 四川 遂宁 629000;
3. 成都儿童专科医院儿科, 四川 成都 610015;
4. 四川大学华西第二医院儿科, 四川 成都 610041
2. Department of Pediatrics, Suining First People's Hospital, Suining 629000, China;
3. Department of Pediatrics, Chengdu Children's Hospital, Chengdu 610015, China;
4. Department of Pediatrics, West China Second University Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是小儿毛细支气管炎最常见的病原体，RSV感染患儿较副流感病毒、肺炎支原体等非RSV感染患儿的预后差，目前尚无有效的预防和治疗措施。RSV感染后炎症调节紊乱是影响病毒清除与疾病病程的重要原因，主要表现为炎症细胞的不断浸润以及细胞因子的大量分泌，在发挥抗病毒作用的同时，也会导致严重的肺损伤[1]。因此，深入探讨RSV感染后炎症紊乱的病理机制具有重要的临床意义。
髓系细胞触发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)可以与下游接头分子DNAX活化蛋白12(DNAX-activating protein 12，DAP12)相互作用，激活炎症信号通路[2-4]。TREM-1在不同种类微生物感染中可能发挥不同作用，如在流感病毒感染模型中TREM-1基因缺失可降低炎症水平[5]；在铜绿假单胞菌感染中发现TREM-1基因缺失可促进炎症因子分泌[6]。但是，TREM-1在RSV毛细支气管炎患儿中的表达及作用目前尚无报道，因此，本文旨在探讨TREM-1、DAP12在RSV毛细支气管炎患儿中的表达，并构建RSV感染人支气管上皮(normal human bronchial epithelial cells，NHBE)细胞模型，以深入研究相关机制。
1 资料与方法 1.1 研究对象选取2017年1月—2019年1月四川省广安市人民医院RSV毛细支气管炎患儿为病例组，共67例。纳入标准：(1)年龄≤2岁；(2)符合《毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识(2014年版)》中的诊断标准[7]；(3)采用鼻咽拭子采集呼吸道分泌物，病原学检查为RSV单一感染；(4)入院前1个月内未经糖皮质激素、免疫抑制剂等药物治疗；(5)入院前病程在3 d内。排除标准：合并肺结核、免疫缺陷病、先天性疾病等。
根据入院lowell评分，将病例组分为轻症组(临床评分≤9分，共39例)和重症组(临床评分≥10分，共28例)。选取同期体检的健康儿童作为对照组，共35例。本研究已获四川省广安市人民医院伦理委员会的批准，且研究对象监护人均已签署知情同意书。
1.2 血清中炎症因子含量的检测治疗前，经肘正中静脉穿刺采集静脉血0.5 mL，分离血清，分装后保存于-80℃冰箱。使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)检测血清中白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)含量。
1.3 外周血单个核细胞中TREM-1、DAP12 mRNA的检测治疗前，经肘正中静脉穿刺采集EDTA抗凝静脉血2 mL，使用人外周血单个核细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。使用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测PBMCs中TREM-1、DAP12 mRNA表达量。以GAPDH作为内参基因，引物序列为：TREM-1上游引物，5’-GAACTCCGAGCTGCAACTAAA-3’；下游引物，5’-TCTAGCGTGTAGTCACATTTCAC-3’。DAP12上游引物，5’-GAGACCGAGTCGCCTTATCA-3’；下游引物，5’-GTCATGATTCGGGCTCATTT-3’。
1.4 PBMCs中TREM-1、DAP12蛋白质的检测蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)检测PBMCs中TREM-1、DAP12蛋白质表达量。常规进行蛋白提取、电泳、转印等步骤，一抗(英国Abcam公司)稀释比例为：TREM-1(1:1 000)、DAP12(1:500)、GAPDH(1:3 000)。上述试验均在四川省广安市人民医院完成。
1.5 细胞学试验 1.5.1 主要试剂NHBE细胞、人喉癌上皮细胞(Hep-2细胞)均购自美国ATCC；RSV病毒(A亚型)购自广州博特生物工程有限责任公司；DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；Lipofectin-2000TM购自美国Invitrogen公司。
1.5.2 细胞与病毒培养NHBE细胞、Hep-2细胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养。将RSV病毒接种至Hep-2细胞，培养3~5 d后收集细胞，反复冻融获取病毒悬液，根据Reed-muench法测定半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose，TCID50)。细胞学试验均于四川大学华西第二医院完成。
1.5.3 RSV感染将NHBE细胞接种于6孔板，待汇合度达到80%左右时，弃去培养基，PBS洗涤2次，依次加入滴度为0、50、100、500 TCID50的RSV病毒悬液，放置于37℃培养箱中吸附2 h，弃去上层悬液，PBS洗涤2次，加入培养基继续培养48 h，然后收集细胞，WB检测不同滴度RSV诱导时NHBE细胞中TREM-1蛋白质的表达。此外，在滴度为100 TCID50的诱导条件下，分别培养0、24、48、72 h，然后收集细胞，WB检测不同诱导时间NHBE细胞中TREM-1蛋白质的表达。
1.5.4 RNA干扰质粒的构建与转染参照文献[8]报道，设计针对人TREM-1的siRNA序列，具体序列为：siRNA-TREM-1正义链，5’-CCGGTG GCAGATAATAAGGGACGGCTCGAGCCGTCC CTTATTATCTGCCTTTTTG-3’；siRNA-TREM-1反义链，5’-AATTCAAAAAGGCAGATAATA AGGGACGGCTCGAGCCGTCCCTTATTATCT GCCA-3’。siRNA-Control正义链，5’-CCGGTGG GAAGTACGGAGTAAACGCTCGAGCGTTTA CTCCGTACTTCCCTTTTTG-3’；siRNA-Control反义链，5’-AATTCAAAAAGGGAAGTACG GAGTAAACGCTCGAGCGTTTACTCCGTACT TCCCA-3’。将上述寡核苷酸单链退火后，克隆至pGenesil-1.1质粒。使用Lipofectin-2000TM将测序正确的siRNA-Control质粒和siRNA-TREM-1质粒转染至NHBE细胞。
1.5.5 试验分组细胞学试验分为4组：对照组、RSV感染组、RSV+siRNA-Control组、RSV+siRNA-TREM-1组。对照组、RSV感染组使用未进行转染的NHBE细胞，RSV+siRNA-Control组和RSV+siRNA-TREM-1组分别使用siRNA-Control质粒和siRNA-TREM-1质粒转染的NHBE细胞。对照组不进行RSV感染，其余3组均使用滴度为100 TCID50的RSV感染，诱导时间为48 h。
1.5.6 检测指标RSV感染48 h后，收集各组细胞及上清液，使用qRT-PCR检测各组细胞中TREM-1、DAP12 mRNA表达，使用WB检测各组细胞中TREM-1、DAP12蛋白表达水平，使用ELISA检测细胞上清液中炎症因子的含量，包括IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1。
使用免疫荧光染色检测各组细胞中TREM-1蛋白表达水平，具体步骤为：4%多聚甲醛固定30 min，封闭1 h，滴加抗TREM-1抗体(1:50)4℃过夜。二抗孵育、DAPI染色、封片等步骤后拍照。
1.6 统计学分析应用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有计量资料均采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P≤0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 基本资料病例组共67例RSV毛细支气管炎患儿，其中轻症组39例，重症组28例。轻症组中男性21例，女性18例，平均年龄(9.16±4.22)个月；重症组中男性13例，女性15例，平均年龄(9.45±4.63)个月。对照组共35例健康儿童，其中男性18例，女性17例，平均年龄(9.28±4.06)个月。三组儿童性别、年龄比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05)。
2.2 各组儿童血清中炎症因子含量的比较轻症组和重症组儿童血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1含量均高于对照组，且重症组IL-1β、IL-8、IL-17、HMGB1含量高于轻症组，差异均具有统计学意义(均P < 0.05)。见表 1。
| 表 1 各组儿童血清中炎症因子含量的比较(pg/mL) Table 1 Comparison of serum levels of inflammatory factors in children of each group (pg/mL) |
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轻症组和重症组儿童PBMCs中TREM-1、DAP12 mRNA及蛋白表达量均高于对照组，且重症组高于轻症组，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。见图 1、图 2。
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| A：qRT-PCR检测TREM-1 mRNA表达；B、C：WB检测TREM-1蛋白表达。1：对照组；2：轻症组；3：重症组。a：与对照组比较，P＜0.05；b：与轻症组比较，P＜0.05。 图 1 各组PBMCs中TREM-1 mRNA和蛋白表达水平 Figure 1 Expression level of TREM-1 mRNA and protein in PBMCs of each group |
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| A：qRT-PCR检测DAP12 mRNA表达；B、C：WB检测DAP12蛋白表达。1：对照组，2：轻症组，3：重症组。a：与对照组比较，P＜0.05；b：与轻症组比较，P＜0.05。 图 2 各组PBMCs中DAP12 mRNA和蛋白表达水平 Figure 2 Expression level of DAP12 mRNA and protein in PBMCs of each group |
随着RSV浓度和诱导时间的增加，NHBE细胞中TREM-1的表达量逐渐升高，RSV浓度为100 TCID50以及诱导时间为48 h时，TREM-1的表达量达到最高。见图 3。
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| A：WB检测不同感染滴度下TREM-1的蛋白表达；B：WB检测不同感染时间下TREM-1的蛋白表达。a：与0 TCID50(或0 h)比较，P＜0.05；b：与50 TCID50(或24 h)比较，P＜0.05。 图 3 RSV诱导NHBE细胞表达TREM-1蛋白水平 Figure 3 Expression level of TREM-1 protein in NHBE cells induced by RSV |
RSV感染组、RSV+siRNA-Control组中TREM-1 mRNA和蛋白量均高于对照组和RSV+siRNA-TREM-1组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见图 4。RSV感染组、RSV+siRNA-Control组的荧光强度强于对照组和RSV+siRNA-TREM-1组，见图 5。
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| A：qRT-PCR检测TREM-1 mRNA转录水平；B、C：WB检测TREM-1蛋白表达。1：对照组；2：RSV感染组；3：RSV+siRNA-Control组；4：RSV+siRNA-TREM-1组。a：与对照组比较，P＜0.05；b：与RSV感染组比较，P＜0.05；c：与RSV+siRNA-Control组比较，P＜0.05。 图 4 各组NHBE细胞中TREM-1 mRNA转录和蛋白表达水平 Figure 4 Expression level of TREM-1 mRNA transcription and protein in NHBE cells of each group |
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| 1：对照组；2：RSV感染组；3：RSV+siRNA-Control组；4：RSV+siRNA-TREM-1组。 图 5 免疫荧光染色检测各组NHBE细胞中TREM-1表达情况 Figure 5 Expression of TREM-1 in NHBE cells by immunofluorescence staining of each group |
RSV感染组、RSV+siRNA-Control组中DAP12 mRNA和蛋白表达量均高于对照组和RSV+siRNA-TREM-1组，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。RSV+siRNA-TREM-1组中DAP12 mRNA和蛋白表达量高于对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见图 6。
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| A：qRT-PCR检测DAP12 mRNA表达；B、C：WB检测DAP12蛋白表达。1：对照组；2：RSV感染组；3：RSV+siRNA-Control组；4：RSV+siRNA-TREM-1组。a：与对照组比较，P＜0.05；b：与RSV感染组比较，P＜0.05；c：与RSV+siRNA-Control组比较，P＜0.05。 图 6 各组NHBE中DAP12 mRNA和蛋白表达水平 Figure 6 Expression level of DAP12 mRNA and protein in NHBE of each group |
RSV感染组、RSV+siRNA-Control组细胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1含量均高于对照组，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。RSV+siRNA-TREM-1组的上述炎症因子含量均低于RSV感染组、RSV+siRNA-Control组，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。RSV+siRNA-TREM-1组的IL-8、IL-17、HMGB1炎症因子含量高于对照组，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。见表 2。
| 表 2 各组细胞上清液中炎症因子含量的比较(pg/mL) Table 2 Comparison of levels of inflammatory factors in cell supernatant of each group (pg/mL) |
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TREM-1是Bouchon等人于2000年首次发现的跨膜糖蛋白，是炎症级联反应中的重要调节因子。尽管目前尚未明确鉴定出TREM-1配体，但间接证据表明损伤相关分子模式(DAMPs)和病原相关分子模式(PAMPs)可活化TREM-1，从而诱导炎症因子分泌[9]。此外，TREM-1其他功能的发现，如促进T细胞增殖，激活抗原呈递细胞，表明TREM-1蛋白在调节宿主对病原微生物的免疫反应中发挥更重要的作用[10]。
最初研究[11]认为TREM-1主要表达于巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞等免疫细胞表面，仅在脓毒症等细菌感染疾病中发挥免疫效应。但近年研究[12-13]发现，TREM-1也表达于气道上皮细胞、软骨细胞等组织细胞表面，参与病毒感染以及无菌性炎症。Yuan等[14]在研究人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)在巨噬细胞中的隐匿机制时发现，HIV可通过NFκB信号通路诱导巨噬细胞高表达TREM-1，增强其抗凋亡能力，而沉默TREM-1表达则可上调Caspase 3表达，下调Bcl-2表达，促进巨噬细胞凋亡，认为靶向沉默TREM-1可能提高HIV的清除率。然而，TREM-1在其他种类病毒感染中的作用仍知之甚少，在RSV毛细支气管炎患儿中的表达情况及作用机制尚无报道。
炎症因子的大量释放是RSV感染与机体免疫屏障相互作用的结果，也是加重肺部病理损伤的原因之一，血清中炎症因子含量与患儿预后密切相关[15]。因此，本文首先对RSV毛细支气管炎患儿血清中炎症因子含量进行检测，ELISA法检测结果表明RSV毛细支气管炎患儿血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1含量均显著升高，而且与病情程度有关。此外，本研究进一步发现TREM-1 mRNA和蛋白在PBMCs中的表达量也显著升高，与炎症因子的升高趋势一致，提示TREM-1可能参与RSV致炎机制。TREM-1的胞浆结构域缺乏信号基序，其功能效应主要依赖于下游接头分子DAP12传递[16]，因此，TREM-1与DAP12的表达趋势常保持一致，本文研究结果显示，DAP12 mRNA和蛋白在PBMCs中高表达，也证实了上述结论。TREM-1/DAP12信号通路介导炎症因子释放的因果关系并不恒定，两者可能相互作用，共同诱导炎症级联扩大。部分研究结果可间接支持这一结论，例如：HMGB1可能是TREM-1的配体[17]；NFκB不仅是TREM-1/DAP12诱导炎症因子释放的下游信号通路，也可上调TREM-1表达，沉默NF-κB p65可抑制HIV相关蛋白Tat或者gp120对TREM-1表达的诱导作用[14]。
为了进一步证实上述结论，本文构建了RSV感染NHBE的体外细胞模型，结果发现RSV可通过浓度和时间依赖的方式诱导TREM-1高表达。以往研究大多认为，TREM-1主要通过炎症细胞发挥生物学效应，如增强细胞迁移能力，促进炎症因子分泌等[18]。本文通过RNA干扰技术对TREM-1进行沉默，发现TREM-1沉默可以下调DAP12表达，降低炎症因子分泌，进一步证实TREM-1是RSV感染后炎症失调的关键分子，为RSV毛细支气管炎治疗提供了新的靶点。
综上所述，TREM-1/DAP12信号通路在RSV毛细支气管炎患儿中高表达。RSV诱导支气管上皮细胞高表达TREM-1，沉默TREM-1可以下调DAP12表达，降低炎症因子分泌。
| [1] |
Russell CD, Unger SA, Walton M, et al. The human immune response to respiratory syncytial virus infection[J]. Clin Microbiol Rev, 2017, 30(2): 481-502. DOI:10.1128/CMR.00090-16 |
| [2] |
Su VY, Yang KY, Chiou SH, et al. Induced pluripotent stem cells regulate triggering receptor expressed on myeloid cell-1 expression and the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in endotoxin-induced acute lung injury[J]. Stem Cells, 2019, 37(5): 631-639. DOI:10.1002/stem.2980 |
| [3] |
Kökten T, Gibot S, Lepage P, et al. TREM-1 inhibition restores impaired autophagy activity and reduces colitis in mice[J]. J Crohns Colitis, 2018, 12(2): 230-244. DOI:10.1093/ecco-jcc/jjx129 |
| [4] |
Subramanian S, Pallati PK, Sharma P, et al. TREM-1 associa- ted macrophage polarization plays a significant role in inducing insulin resistance in obese population[J]. J Transl Med, 2017, 15(1): 85. DOI:10.1186/s12967-017-1187-7 |
| [5] |
Weber B, Schuster S, Zysset D, et al. TREM-1 deficiency can attenuate disease severity without affecting pathogen clearance[J]. PLoS Pathog, 2014, 10(1): e1003900. DOI:10.1371/journal.ppat.1003900 |
| [6] |
Klesney-Tait J, Keck K, Li X, et al. Transepithelial migration of neutrophils into the lung requires TREM-1[J]. J Clin Invest, 2013, 123(1): 138-149. DOI:10.1172/JCI64181 |
| [7] |
《中华儿科杂志》编辑委员会, 中华医学会儿科学分会呼吸学组. 毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识(2014年版)[J]. 中华儿科杂志, 2015, 53(3): 168-171. DOI:10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2015.03.003 |
| [8] |
Tang J, Dong Q. Knockdown of TREM-1 suppresses IL-1β-induced chondrocyte injury via inhibiting the NF-κB pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 482(4): 1240-1245. DOI:10.1016/j.bbrc.2016.12.019 |
| [9] |
Pelham CJ, Pandya AN, Agrawal DK. Triggering receptor expressed on myeloid cells receptor family modulators:a patent review[J]. Expert Opin Ther Pat, 2014, 24(12): 1383-1395. DOI:10.1517/13543776.2014.977865 |
| [10] |
Pelham CJ, Agrawal DK. Emerging roles for triggering receptor expressed on myeloid cells receptor family signaling in inflammatory diseases[J]. Expert Rev Clin Immunol, 2014, 10(2): 243-256. DOI:10.1586/1744666X.2014.866519 |
| [11] |
Poukoulidou T, Spyridaki A, Mihailidou I, et al. TREM-1 expression on neutrophils and monocytes of septic patients:relation to the underlying infection and the implicated pathogen[J]. BMC Infect Dis, 2011, 11: 309. DOI:10.1186/1471-2334-11-309 |
| [12] |
Rigo I, McMahon L, Dhawan P, et al. Induction of triggering receptor expressed on myeloid cells (TREM-1) in airway epithelial cells by 1, 25(OH)2 vitamin D3[J]. Innate Immun, 2012, 18(2): 250-257. DOI:10.1177/1753425911399796 |
| [13] |
Ruiz-Pacheco JA, Vivanco-Cid H, Izaguirre-Hernández IY, et al. TREM-1 modulation during early stages of dengue virus infection[J]. Immunol Lett, 2014, 158(1-2): 183-188. DOI:10.1016/j.imlet.2014.01.003 |
| [14] |
Yuan Z, Fan X, Staitieh B, et al. HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of triggering receptor expressed on myeloid cells-1[J]. Sci Rep, 2017, 7: 42028. DOI:10.1038/srep42028 |
| [15] |
Fan R, Wen B, Liu W, et al. Altered regulatory cytokine profiles in cases of pediatric respiratory syncytial virus infection[J]. Cytokine, 2018, 103: 57-62. DOI:10.1016/j.cyto.2017.12.028 |
| [16] |
Arts RJ, Joosten LA, van der Meer JW, et al. TREM-1:intracellular signaling pathways and interaction with pattern recognition receptors[J]. J Leukoc Biol, 2013, 93(2): 209-215. DOI:10.1189/jlb.0312145 |
| [17] |
El Mezayen R, El Gazzar M, Seeds MC, et al. Endogenous signals released from necrotic cells augment inflammatory responses to bacterial endotoxin[J]. Immunol Lett, 2007, 111(1): 36-44. |
| [18] |
Cao C, Gu J, Zhang J. Soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1(sTREM-1):a potential biomarker for the diagnosis of infectious diseases[J]. Front Med, 2017, 11(2): 169-177. DOI:10.1007/s11684-017-0505-z |