肾缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是指组织因为某种原因导致出现一段时间缺血,当组织恢复血液供应后发生的组织损伤现象。它是一种复杂的病理过程,是导致急性肾功能损伤(acute kidney injury,AKI)的主要原因,能快速导致肾功能障碍,且具有较高的死亡率[1]。因此,开发研究能有效抑制或避免RIRI的药物十分必要。近年来,植物提取物逐渐走进世界医学界研究者的视野,在很多疾病的治疗/辅助治疗中起到很重要的作用。如张玉森等[2]研究表明,茶多酚增强了阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease,AD)的抗氧化能力,同时调控凋亡相关蛋白表达,从而改善了模型动物的神经功能。而十字花科独行菜属植物玛咖的水提物在缺氧细胞损伤模型中也表现出强大的抗氧化能力[3]。三七皂甙R1(notoginsenoside R1,SR1)是传统中药三七的特征性成分,具有多种生物学活性,如抗凋亡、自噬激活、抗炎、抑制缺血再灌注损伤、清除氧自由基等作用[4 – 7],而三七皂苷Rg1(notoginsenoside Rg1,NRg1)同样是三七的活性成分之一。为此,本研究采用夹闭双侧肾动脉45 min后再灌注24 h的方法建立RIRI模型,探讨NRg1对大鼠RIRI的保护作用及其对氧化应激水平和外周血Th1/Th2细胞因子的调节作用。结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器NRg1对照品(上海Sigma公司),血清肌酐、尿素氮试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司),苏木精 – 伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色试剂盒(北京博奥森公司),大鼠外周血淋巴细胞分离液(上海Bioswamp公司);尿蛋白、超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物(glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒(南京建成生物工程研究所),一抗和二抗(北京Abcam公司);Bio-rad基因扩增仪、Bio-rad电泳仪和Trans-Blot Turbo转膜仪(美国伯乐公司),Gel View 6000化学发光凝胶成像系统(广州云星仪器有限公司),CENTRA CL3-R低温高速离心机(美国IEC公司),BX43-32PO1显微镜(日本奥林巴斯公司),FACSAriaII流式细胞仪(美国BD公司)。
1.2 实验动物及饲养健康雄性SD大鼠60只,购自北京维通利华公司,许可证号:SCXK(京)2014 – 0001,体重(205.2 ± 16.7)g。饲养条件:温度18~26 ℃,湿度40 %~70 %,自由进食进水。大鼠适应性喂养1周,随机分为5组,每组12只,分别为假手术组、模型组、NRg1 2.5 mg/kg组、NRg1 5.0 mg/kg组、NRg110.0 mg/kg组。禁食12 h后,于造模前5 d开始每天灌胃给药1次,连续5 d,假手术组和模型组均给予等量的灭菌生理盐水,NRg1 2.5、5.0和10.0 mg/kg组分别灌胃给予NRg1 2.5、5.0和10.0 mg/kg。参照文献[ 8 – 9]方法于末次给药后1 h采用夹闭双侧肾动脉45 min后再灌注24 h的方法造模,假手术组大鼠除不夹闭肾动脉外,其余操作同模型组。再灌注24 h后,取材进行后续实验。
1.3 指标与方法 1.3.1 尿蛋白、血清肌酐和尿素氮检测造模后大鼠禁食,在代谢笼中留取24 h尿液,检测尿量;收集尿液后2 000 r/min离心10 min,取上清检测尿蛋白含量。腹主动脉采血5 mL,4 ℃自然凝结30 min,离心去上清检测血清肌酐和尿素氮含量。
1.3.2 Th1(inducible nitric oxide synthase positive,iNOS+)细胞和Th2(interleukin 10 positive,IL-10+)细胞表达检测取血置于抗凝管中,轻轻混匀后加入等体积磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)进行稀释,加入稀释血样2倍量的外周血淋巴细胞分离液于灭菌离心管中,再将稀释血样沿管壁缓慢加入该离心管中,2 000 r/min离心20 min;小心吸取交界面处的乳白色浑浊细胞层,置于另一灭菌离心管中,加入PBS洗涤3次,最后用含10 % 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)的洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)1640重悬细胞,置于恒温细胞培养箱中培养,用流式细胞仪分选细胞。
1.3.3 肾组织病理学观察肾组织经10 % 福尔马林固定,酒精梯度脱水,石蜡包埋后,制作成4 μm厚度的切片,行HE染色和TUNEL染色。HE染色观察肾脏组织中肾小球和肾小管等病理改变;TUNEL染色观察肾脏细胞凋亡率,即镜下胞核呈棕黄色的细胞比率。
1.3.4 肾组织中SOD和Gpx含量检测组织匀浆后离心,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)取上清严格按试剂盒说明书检测SOD和GSH-Px含量。
1.3.5 大鼠肾脏相关蛋白表达检测采用蛋白印迹法,用含蛋白抑制剂的蛋白裂解液于冰上裂解各组肾组织后,提取总蛋白,4 ℃离心收集,取上清,用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法试剂盒进行蛋白定量。100 ℃变性10 min,每组取等量蛋白质进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),转移蛋白质到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。用5 % 脱脂奶粉室温封闭蛋白质2 h,加入B细胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)、核转录相关因子2(nuclear factor E2 related factor,Nrf2)、谷胱甘肽 – S – 转移酶(glutathione S-transferase,GST)和醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinoneoxidoreductase 1,NQO1]的一抗,4 ℃孵育过夜。弃去一抗,再加入稀释的辣根过氧化物酶标记的对应二抗,室温孵育2 h。采用电化学(electrochemiluminescence,ECL)发光法于暗室曝光显影,以磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参。
1.4 统计分析实验数据用
与假手术组比较,模型组RIRI大鼠尿蛋白、血清肌酐和尿素氮含量均增加(均P < 0.01);与模型组比较,NRg1 2.5、5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠尿蛋白、血清肌酐和尿素氮含量均减少(均 P < 0.01);与NRg1 2.5 mg/kg组比较,5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠尿蛋白、血清肌酐和尿素氮含量均减少(均 P < 0.05);与NRg1 5.0 mg/kg组比较,10.0 mg/kg组RIRI大鼠尿蛋白、血清肌酐和尿素氮含量均减少(均 P < 0.05)。
2.2 NRg1对RIRI大鼠肾脏病理改变的影响(图1)对各组大鼠肾组织切片进行HE染色,镜下观察发现,假手术组大鼠肾组织肾小球体积基本正常,未见其系膜细胞增生,肾小管间质区结构清晰,胞浆丰富、细胞排列紧密;而模型组大鼠肾组织镜下可见肾小球体积明显增大,系膜基质增多,肾小管可见明显肿胀、空泡样变性和坏死、间质充血、水肿和炎性浸润;与模型组相比,NRg1 2.5、5.0和10.0 mg/kg组大鼠肾组织病变明显减轻,仅可见少量肾小管细胞轻度肿胀、空泡样变性。TUNEL染色结果显示,与假手术组大鼠肾脏细胞凋亡率的[(3.1 ± 2.0)%]相比,模型组RIRI大鼠肾脏细胞凋亡率[(72.6 ± 9.1)%]明显升高,而NRg1 2.5、5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠肾脏细胞凋亡率[分别为(43.6 ± 7.5)%、(32.4 ± 8.1)% 和(11.7 ± 6.3)%]较模型组RIRI大鼠均降低,差异均有统计学意义(均P < 0.01),且随着NRg1浓度的增大,肾脏细胞凋亡率明显降低。
2.3 NRg1对RIRI大鼠Bcl-2和Bax蛋白表达的影响(图2、表2)与假手术组比较,模型组RIRI大鼠Bcl-2蛋白表达增加、Bax蛋白表达减少(均P < 0.01);与模型组比较,NRg1 2.5、5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠Bcl-2蛋白表达均减少、Bax蛋白表达均增加(均 P < 0.01);与NRg1 2.5 mg/kg组比较,5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠Bcl-2蛋白表达均减少、Bax蛋白表达均增加(均 P < 0.05);与NRg1 5.0 mg/kg组比较,10.0 mg/kg组RIRI大鼠Bcl-2蛋白表达减少、Bax蛋白表达增加(均 P < 0.05)。
2.4 NRg1对RIRI大鼠GSH-Px和SOD含量的影响(表3)与假手术组比较,模型组RIRI大鼠GSH-Px和SOD含量均减少(均P < 0.01);与模型组比较,NRg1 2.5、5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠GSH-Px和SOD含量均增加(均 P < 0.01);与NRg1 2.5 mg/kg组比较,5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠GSH-Px和SOD含量均增加(均 P < 0.05);与NRg1 5.0 mg/kg组比较,10.0 mg/kg组RIRI大鼠GSH-Px和SOD含量均增加(均 P < 0.05)。
2.5 NRg1对RIRI大鼠氧化应激通路相关蛋白表达的影响(图3、表4)与假手术组比较,模型组RIRI大鼠Nrf2、GST和NQO1蛋白表达均减少(均P < 0.01);与模型组比较,NRg1 2.5、5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠Nrf2、GST和NQO1蛋白表达均增加(均 P < 0.01);与NRg1 2.5 mg/kg组比较,5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠Nrf2、GST和NQO1蛋白表达均增加(均 P <0.05);与NRg1 5.0 mg/kg组比较,10.0 mg/kg组RIRI大鼠Nrf2、GST和NQO1蛋白表达均增加(均 P < 0.05)。
2.6 NRg1对RIRI大鼠外周血Th1(iNOS+)和Th2(IL-10+)含量的影响(表5)与假手术组比较,模型组RIRI大鼠Th1(iNOS+)含量增加、Th2(IL-10+)含量减少(均P < 0.01);与模型组比较,NRg1 2.5、5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠Th1(iNOS +)含量均减少、Th2(IL-10+)含量均增加(均P < 0.01);与NRg1 2.5 mg/kg组比较,5.0和10.0 mg/kg组RIRI大鼠Th1(iNOS +)含量均减少、Th2(IL-10+)含量均增加(均P < 0.05);与NRg1 5.0 mg/kg组比较,10.0 mg/kg组RIRI大鼠Th1(iNOS +)含量减少、Th2(IL-10+)含量增加(均P < 0.05)。
3 讨 论肾脏是机体灌注量最大的器官,对缺氧和缺血均较敏感,RIRI是急性肾衰竭最主要的并发症,是临床上常见的多因素导致的动态过程,氧自由基过度产生、炎症反应、钙离子超载、细胞凋亡、氧化应激、前炎性蛋白及内皮素与其受体等可能参与其中。有研究表明,SR1能保护糖尿病大鼠肾脏足细胞免受氧化损伤,并通过抑制炎症反应和细胞凋亡以改善RIRI[10 – 11],而NRg1对肾脏的研究鲜少报道。
生理状态下,肾小球滤过膜不允许大分子量的蛋白滤过,仅有少量小分子蛋白可以通过肾小球的滤过作用进入肾小管,但在近曲小管处大部分蛋白又将被重吸收回血液循环中。因此,检测微量白蛋白尿是传统的糖尿病肾病的诊断方法[12]。本研究结果显示,在夹闭双侧肾动脉45 min后再灌注24 h建立RIRI模型后,NRg1明显降低了大鼠尿蛋白、血清肌酐和尿素氮含量,提示NRg1具有维持肾脏细胞膜完整性的作用。有研究表明,在RIRI模型中,薰衣草油降低了模型大鼠肾脏TUNEL阳性细胞比率,减少肾小管周围毛细血管的损伤,从而有效维持了大鼠肾脏的基本结构[13]。Fas/fasl介导的信号通路能促进RIRI诱导细胞凋亡,但预处理给予该通路上游调控基因沉默交配型信息调控2同源物(silent mating type information regulation 2 homolog,SIRT2)的抑制剂可以明显减少肾小管细胞凋亡数量,减轻超微结构损伤,从而有效治疗RIRI[14]。
本研究通过HE和TUNEL染色发现,NRg1治疗模型大鼠后,明显减轻了肾小球和肾小管的病理损伤,同时降低了肾脏细胞的凋亡水平,提示NRg1能通过改善模型大鼠肾脏微结构损伤和细胞凋亡来维持肾脏结构和功能。本研究还发现,抗凋亡蛋白Bcl-2在NRg1治疗组中均呈现表达上调,而Bax则被抑制,进一步证明了NRg1在RIRI模型中的抗凋亡作用。
SOD是机体天然存在的超氧化物清除剂,能增强细胞的抗氧化损伤能力,减轻细胞损伤。本研究结果显示,NRg1组大鼠血清中GSH-Px和SOD含量均较模型组增加,这与NRg1在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用机制相似,Yu等[6]研究表明,NRg1在0~20 μmol剂量范围内,可降低丙二醛含量和肌酐激酶,提高SOD、GSH-Px和过氧化氢酶活性。
此外,缺血再灌注损伤会不可避免地引起包括活性氧、细胞因子、趋化因子和白细胞活化的炎症级联,其中信号通路在机体生理病理过程中发挥着非常重要的作用[15]。Nrf2是转录因子家族的成员,生理状态下以非活性状态存在于胞浆内;当被激活时,Nrf2核易位到细胞核内,启动保护性蛋白基因GST、血红素氧合酶1或NQO1促使其表达[16]。本文建立RIRI模型,探讨NRg1对模型大鼠氧化应激的作用发现,NRg1能有效调节Nrf2抗氧化通路及其下游蛋白的表达,这与昆布多糖调节Nrf2信号通路,使人肺成纤维细胞MRC-5免受过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的氧化损伤的机制一致[17]。
一氧化氮(nitric oxide,NO)作为内皮细胞产物在机体血液循环中起着重要作用,低浓度的NO被认为对RIRI具有保护作用[18],在超氧化物存在时,NO失活成为过氧亚硝基阴离子,导致细胞损伤[3]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)具有内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、神经型(neuronal oxide synthase,nNOS)和诱导型(inducible oxide synthase,iNOS)3种不同亚种,前两者在生理状态下短时间内释放低浓度NO,而后者能产生高浓度的NO。RIRI能激活NOS,增加其蛋白表达[19],而增加调节性T细胞能改善RIRI[20]。如,尼古丁作为一种抗炎的胆碱能激动剂,可以通过减少中性粒细胞浸润起到RIRI肾脏保护功能[21]。本研究结果显示,在RIRI模型中,NRg1治疗组大鼠Th1(iNOS+)含量减少,Th2(IL-10+)含量增加,从而在一定程度上改善了Th1/Th2的不平衡,降低免疫损伤。
综上所述,NRg1能改善RIRI模型大鼠的肾脏微结构改变,减少细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达,抵抗氧化应激对肾脏造成的损伤,并能通过调节Th1/Th2平衡,从而起到对RIRI的保护作用。
[1] | Levey AS, James MT. Acute kidney injury[J]. Ann Intern Med, 2018, 168(11): 837. |
[2] | 张玉森, 董瑞瑞, 杨倩, 等. 茶多酚联合原花青素改善AD大鼠记忆作用及机制[J]. 中国公共卫生, 2019, 25(3): 304–308. |
[3] | 张静, 陈萌, 赵君, 等. 玛咖水提物在PC12细胞对抗化学性缺氧损伤中的作用[J]. 中国公共卫生, 2019, 25(3): 309–312. |
[4] | Huang G, Zou B, Lü J, et al. Notoginsenoside R1 attenuates glucose-induced podocyte injury via the inhibition of apoptosis and the activation of autophagy through the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J]. Int J Mol Med, 2017, 39(3): 559–568. DOI:10.3892/ijmm.2017.2864 |
[5] | Zhang J, Ding L, Wang B, et al. Notoginsenoside R1 attenuates experimental inflammatory bowel disease via pregnane X receptor activation[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2015, 352(2): 315–324. DOI:10.1124/jpet.114.218750 |
[6] | Yu Y, Sun G, Luo Y, et al. Cardioprotective effects of notoginse-noside R1 against ischemia/reperfusion injuries by regulating oxida-tive stress- and endoplasmic reticulum stress-related signaling pathways[J]. Sci Rep, 2016, 6: 21730. DOI:10.1038/srep21730 |
[7] | Su P, Du S, Li H, et al. Notoginsenoside R1 inhibits oxidized low-density lipoprotein induced inflammatory cytokines production in human endothelial EA. hy926 cells[J]. Eur J Pharmacol, 2016, 770: 9–15. DOI:10.1016/j.ejphar.2015.11.040 |
[8] | Rahmania L, Orbegozo D, Su F, et al. Administration of tetrahy-drobiopterin (BH4) protects the renal microcirculation from ischemia and reperfusion injury[J]. Anesth Analg, 2017, 125(4): 1253–1260. DOI:10.1213/ANE.0000000000002131 |
[9] | Fu Y, Lin Q, Gong T, et al. Renal-targeting triptolide-glucosamine conjugate exhibits lower toxicity and superior efficacy in attenua-tion of ischemia/reperfusion renal injury in rats[J]. Acta Pharmacol Sin, 2016, 37(11): 1467–1480. DOI:10.1038/aps.2016.44 |
[10] | Huang G, LÜ J, Li T, et al. Notoginsenoside R1 ameliorates podocyte injury in rats with diabetic nephropathy by activating the PI3K/Akt signaling pathway[J]. Int J Mol Med, 2016, 38(4): 1179–1189. DOI:10.3892/ijmm.2016.2713 |
[11] | Liu WJ, Tang HT, Jia YT, et al. Notoginsenoside R1 attenuates renal ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Shock, 2010, 34(3): 314–320. DOI:10.1097/SHK.0b013e3181ceede4 |
[12] | Papadopoulou-Marketou N, Chrousos GP, Kanaka-Gantenbein C. Diabetic nephropathy in type 1 diabetes: a review of early natural history, pathogenesis, and diagnosis[J]. Diabetes Metab Res Rev, 2017, 33(2): e2841. DOI:10.1002/dmrr.v33.2 |
[13] | Aboutaleb N, Jamali H, Abolhasani M, et al. Lavender oil (Lavan-dula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 110: 9–19. |
[14] | Wang Y, Mu Y, Zhou X, et al. SIRT2-mediated FOXO3a deacetyla-tion drives its nuclear translocation triggering FasL-induced cell apoptosis during renal ischemia reperfusion[J]. Apoptosis, 2017, 22(4): 519–530. DOI:10.1007/s10495-016-1341-3 |
[15] | Moreth K, Frey H, Hubo M, et al. Biglycan-triggered TLR-2- and TLR-4-signaling exacerbates thepathophysiology of ischemic acute kidney injury[J]. Matrix Biol, 2014, 35: 143–151. DOI:10.1016/j.matbio.2014.01.010 |
[16] | Gogoi K, Manna P, Dey T, et al. Circulatory heavy metals (cad-mium, lead, mercury, and chromium) inversely correlate with plasma GST activity and GSH level in COPD patients and impair NOX4/Nrf2/GCLC/GST signaling pathway in cultured mono-cytes[J]. Toxicol In Vitro, 2019, 54: 269–279. DOI:10.1016/j.tiv.2018.10.010 |
[17] | Liu X, Liu H, Zhai Y, et al. Laminarin protects against hydrogen peroxide-induced oxidative damage in MRC-5 cells possibly via regulating NRF2[J]. PeerJ, 2017, 5: e3642. DOI:10.7717/peerj.3642 |
[18] | Malek M, Nematbakhsh M. Renal ischemia/reperfusion injury: from pathophysiology to treatment[J]. J Renal Inj Prev, 2015, 4(2): 20–27. |
[19] | Viñas JL, Sola A, Genescà M, et al. NO and NOS isoforms in the development of apoptosis in renalischemia/reperfusion[J]. Free Radic Biol Med, 2006, 40(6): 992–1003. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2005.10.046 |
[20] | Koo TY, Lee JG, Yan JJ, et al. The P2X7 receptor antagonist, oxidized adenosine triphosphate, ameliorates renal ischemia-reperfusion injury by expansion of regulatory T cells[J]. Kidney Int, 2017, 92(2): 415–431. DOI:10.1016/j.kint.2017.01.031 |
[21] | Sadis C, Teske G, Stokman G, et al. Nicotine protects kidney from renal ischemia/reperfusion injury through thecholinergic anti-inflammatory pathway[J]. PLoS One, 2007, 2(5): e469. DOI:10.1371/journal.pone.0000469 |