放射性脑损伤为头颅经放射治疗导致神经系统损害,多表现为进行性认知、记忆、理解、信息处理能力受损,影响患者生存质量。海马为大脑中最重要的脑区之一,与认知记忆密切相关,研究发现,放射性脑损伤认知受损程度与海马凋亡高度相关[1 – 2]。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)是枸杞的主要有效成分,具有神经保护作用,能够改善神经病变和神经缺损[3 – 5];但LBP对放射性脑损伤的作用尚未见报道。为观察LBP对大脑放射性脑损伤海马神经元凋亡的保护作用,本研究拟从动物实验和细胞实验观察LBP对大脑放射性脑损伤和放射性损伤原代培养海马神经元的保护作用,并观察其与氧化应激和PI3K/Akt/mTOR信号通路的关系。
1 材料与方法 1.1 实验动物与材料雄性SD大鼠体重180~200克8只每组16只,孕17天SD大鼠,SPF级,SCXK(京)2015-0036,北京维通利华公司采购。动物实验得到中国医科大学附属第一医院动物伦理委员会批准。TUNEL凋亡试剂盒(美国罗氏公司),尼氏染色试剂盒(北京雷根生物科技有限公司),MTT(美国Sigma公司),磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(phosphorylated serine/threonine kinase,pAkt)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因蛋白(B-cell lymphoma/leukemia 2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白基因蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)均购自英国Abcam公司,蛋白质定量试剂盒(Bradford法,P1510)、caspase-3活性测定试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司,谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所,LBP购于上海康舟真菌多糖公司。
1.2 实验仪器– 80 ℃冰箱(MDF-U73V,日本SANYO公司),OLYPUS X71光学显微镜(日本索尼公司),Western blot系统(美国BIO-RAD公司),Morris水迷宫(XR-XM101,上海欣软信息科技有限公司),紫外分光光度计(UV-7504,上海欣茂仪器有限公司),细胞培养箱(美国Thermo Forma 公司)。
1.3 方法 1.3.1 体内实验(A)分组及模型建立大鼠称重,4 % 水合氯醛腹腔注射(1ml/100g)麻醉,俯卧位固定于自制木板架上,直线加速器6MeV电子线对模型A(ModA)组、枸杞多糖A(LBPA)组大鼠行全脑单次20 Gy垂直照射,吸收剂量率为200 cGy/min,源皮距100 cm,在10 cm × 10 cm的限光筒铅模中,照射野大小为2.5 cm × 2.5 cm,照射野前界为双眼内眦连线,后界为双耳后连线。对照A(ConA)组大鼠麻醉后,放入相同环境,但不予照射。LBPA组在照射前2周采用枸杞多糖50 mg/kg灌胃,ConA组和ModA组予以等剂量生理盐水灌胃,至照射结束后30天行后续实验。
1.3.2 水迷宫实验使用Morris水迷宫评价大鼠认知功能[5]。定位航行实验:将大鼠随机从4个象限入水,记录每只大鼠入水后2 min内到达隐蔽平台的时间,即为逃避潜伏期。若2 min内未到达平台,记录为潜伏期120 s。空间探索实验:实验第6天,移走平台,大鼠随机从任意入水点入水,观察大鼠穿过平台区域的时间,即为空间探索时间。
1.3.3 体内实验指标大鼠给药结束后灌注固定:取脑内海马组织,低温冰冻切片,行尼氏染色,显微镜下观察,行TUNEL染色,计算细胞凋亡率;分离海马组织,组织匀浆;测定氧化应激指标MDA含量、GSH-PX和SOD活性。
1.3.4 体外实验(B)原代胎鼠海马神经元的培养原代海马神经元取自孕17d SD 大鼠胚胎,镜下解剖大鼠海马,进行海马神经元的培养,细胞培养第7天,枸杞多糖B(LBPB)组中提前1h加入药物枸杞多糖,终浓度为50 μg/ml,对照B(ConB)组和模型B(ModB)组加入等体积细胞培养液。ModB组和LBPB组采用直线加速器,剂量率400cGy/min的6MV的X线照射,单次照射剂量为30Gy。照射后继续培养行下一步研究。
1.3.5 体外实验指标细胞活性测定使用MTT方法,计算细胞存活率;流式细胞仪检测海马神经元细胞凋亡;Western blot 测定BAX、BCL-2、AMPK、pAMPK、mTOR蛋白的表达。
1.4 统计分析采用SPSS18.0软件进行分析,采用方差分析进行多组间比较,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 体内实验(A)枸杞多糖对放射性脑病大鼠海马CA3区神经元形态的影响ConA组大鼠海马CA3神经元细胞层次丰富,排列整齐,包膜完整,形态正常,未见细胞坏死。ModA组大鼠海马神经元层次变少,细胞萎缩、排列稀疏,胞核变小甚至固缩,坏死细胞多见。LBPA组海马神经元细胞层次丰富,细胞形态规则,坏死细胞较少,较ModA组大鼠海马神经元形态改善显著。
2.2 体内实验(A)枸杞多糖对放射性脑病大鼠海马神经元细胞凋亡的影响ConA组凋亡细胞数量少见,凋亡率(8.7 ± 1.86)%;ModA组凋亡细胞显著增加(42.8 ± 4.95)%,与ConA组相比具有统计学差异(P < 0.01);LBPA组凋亡率(19.4 ± 1.93)%,与ModA组比较差异有统计学意义( P < 0.01)。
2.3 体内实验(A)枸杞多糖放射性脑病大鼠海马MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响(表1)与ConA组比较,ModA组MDA含量明显升高(P < 0.05)、SOD( P < 0.05)和GSH-Px( P < 0.05)活性明显降低;与ModA组比较,LBPA组MDA含量明显降低( P < 0.05)、SOD( P < 0.05)和GSH-Px( P < 0.05)活性明显升高。
2.4 体外实验(B)各组原代胎鼠海马神经元细胞的存活率及凋亡率ConB组海马神经元细胞生长良好;ModB组海马神经元出现大量凋亡及坏死细胞,细胞出现萎缩,生长稀疏,活力下降;LBPB组海马神经元出现部分坏死及凋亡细胞,但较ModB组明显改善。ConB组、ModB组、LBPB组胎鼠海马神经元细胞存活率分别为100 %、(38.8 ± 14.4)%、(77.2 ± 13.6)%;ModB组较ConB组存活率明显下降(P < 0.01),LBPB组较ModB组存活率明显上升( P < 0.01)。ConB组、ModB组、LBPB组凋亡率分别为(6.8 ± 4.08)%、(44.5 ± 3.87)%、(26.6 ± 7.27)%;ModB组凋亡率较ConB组明显增加( P < 0.01),LBPB组较ModB组明显降低( P < 0.01)。
2.5 体外实验(B)各组原代胎鼠海马神经元细胞PI3K/Akt/mTOR/BAX/Bcl-2蛋白表达(图1)ModB组Bax、capsase-3表达较ConB组增加,PI3K、Akt、mTOR、Bcl-2表达较ConB组降低。LBPB组Bax、capsase-3表达较ModB组降低,PI3K、Akt、mTOR、Bcl-2表达较ModB组增加。
3 讨 论放射性脑损伤是头颈部肿瘤患者放疗后的并发症之一,常导致患者认知功能障碍,影响生活质量。如何防治放射性脑损伤亦成为重要议题。枸杞多糖是枸杞主要的有效成分。近年来,多项研究显示,枸杞多糖对帕金森病[6]、癫痫[7]、脑缺血[8 – 9]、视网膜损伤[10 – 11]等均有保护作用,枸杞多糖还具有抗神经系统肿瘤的作用[12]。本研究显示,枸杞多糖在体内实验能够减轻放射性脑损伤大鼠的认知功能障碍,抑制海马神经元的凋亡;在体外实验能够减少放射性脑损伤模型海马神经元细胞的凋亡率,提高存活率,提示枸杞多糖对放射性脑损伤大鼠具备神经保护作用。神经细胞经放射性照射后胞体内出现大量氧自由基及炎性介质,同时线粒体功能受到放射性损伤,氧自由基清除减少,导致自由基大量蓄积,诱发炎性反应,促进细胞凋亡,此为放射性脑损伤的重要原因之一[1];MDA、SOD和GSH-Px是氧化应激的标志性物质。枸杞多糖具有抗氧化应激作用[13 – 14];本研究显示,与模型组相比,LBP组MDA含量显著降低,SOD和GSH-Px活性显著升高,提示枸杞多糖能够改善放射性脑损伤的氧化应激反应。PI3K/Akt/mTOR 信号通路在放射性脑损伤过程神经细胞存活、凋亡过程中发挥重要的生物学功能[15]。放射性损伤造成线粒体膜电位的下降甚至破坏线粒体,进而抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,诱导细胞凋亡[1]。Caspases是细胞凋亡程序执行者,其表达的升高可促进细胞凋亡。Bax是促凋亡基因,Bcl-2是抑制凋亡基因,两者广泛分布于线粒体内膜、核膜、细胞内质网等。多项研究显示,枸杞多糖能够通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路改善脑缺血再灌注的神经缺损症状[16],减轻神经细胞凋亡[17]。本研究显示,枸杞多糖能够抑制放射性脑损伤大鼠海马的氧化应激,同时能够增强氧糖剥夺/复氧海马神经元细胞的PI3K/Akt/mTOR信号通路的表达,升高Bcl-2表达,降低Bax和caspase-3的表达,上述作用与其神经保护功能相关。
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