禽流感（avian influenza，AI）是禽鸟之间的传染病，主要由甲型流感病毒引起且易感于鸭和鹅等野生类水禽^[1]。H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIVs）为低致病性病毒^[2]。但近年国内外调查发现，低致病性禽流感具有发生复杂的基因重组和交换的可能，故研究H6亚型禽流感病毒对于控制未来可能威胁人类健康的流感病毒的流行至关重要^[3-4]。目前，在RNA病毒复制，外源糖蛋白的功能和疫苗评价等领域上已经广泛开始利用VSV为骨架构建的假病毒系统进行研究。此假病毒系统也开展用于禽流感病毒的研究。因此，本研究通过构建含有H6N2型禽流感病毒HA蛋白VSV假病毒，旨在为后续的病毒受体、中和表位的进一步研究及筛选抗流感病毒的药物提供一定的思路和技术支持。

Trizol LS（美国Invitrogen公司），Prime-Script^TM RT Master Mix逆转录试剂盒（日本Takara公司），EX Taq扩增酶（日本Takara公司），DNA纯化试剂盒（日本Takara公司），限制性内切酶（日本Takara公司），DH5α 感受态细胞（日本Takara公司），质粒中量抽提试剂盒（美国Omega公司），胶回收试剂盒（中国碧云天生物制药公司），Western blot试剂盒（美国Pfizer公司），辣根过氧化物酶（horseradish peroxide，HPR）标记的羊抗兔IgG（A/duck/Hainan/6/2004）（美国Enzyme公司），DMEM培养基（美国Bolegend公司），PEI转染试剂，Opti-MEM无血清培养基（美国Bolegend公司），10 % 热灭活胎牛血清（美国Thermo Fisher Scientitic公司），293T细胞（美国ATCC American Type Culture Collection），PCR仪器（美国MJU公司），超速离心机（美国DUPONT/SORVALL公司），化学发光凝胶成像系统（美国Omegalum C公司），恒温摇床（上海智城科技投资有限公司），DMIL-PHI荧光倒置相差显微镜（德国LEICA公司）。

用DMEM培养基培养的 293T 细胞以 37 ℃的条件放置于 5 %的 CO₂ 孵育箱中进行孵育，培养基包含10 %热灭活胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。

感病毒A/greenpeafowl/Qinghuandao/55/12（H6N2）（GP/QHD/55）中提取病毒RNA，使用Takara Prime-Script^TM RT Master Mix逆转录试剂盒及特异性引物Uni12：5′-AGCAAAAGCAGG-3′逆转录出全长CDNA模板，选取HA基因序列，设计引物上游：5′-ATGATTGCAATCATTGTAAT-3′下游：5′-TTATATACATATCCTGCAT-3′，扩增目的基因，并进行琼脂糖电泳验证。

CGC GGATCC ACC XhoI：CCG CTCGAG 限制性内切酶酶切并与pcDNA3.1 + 载体连接，转化DH5α感受态细胞制备重组表达载体pcDNA3.1HA，并进行酶切鉴定。

感染VSV-ΔG^*-G为阴性对照，使用PEI转染试剂转染293T细胞，在293T细胞转染pcDNA3.1HA 36 h后，加入VSV-ΔG^*-G于37 ℃CO₂孵育箱中感染2 h，弃去液体，使用磷酸盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2次，加入培养基，在37 ℃CO₂孵育箱中孵育24 h，超低速离心机离心后保存于 – 80 ℃冰箱中，在293T细胞下进行假型病毒测定，在六孔板上生长的293T细胞用200 μL病毒原液感染，1 h 吸附后，除去接种物，加入新鲜培养基，并将细胞在 37 ℃ CO ₂ 孵育箱下孵育 16 h，于荧光显微镜下进行检测，记录细胞图像。

将重组质粒pcDNA3.1HA转染至293T细胞提取细胞蛋白，选取20 μL样品加入到10 % 的凝胶电泳中，跑胶75 V 30 min后调节电压至100 V 90 min，切胶转移样本到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，以兔抗（A/duck/Hainan/6/2004）（H6N2）多克隆抗体为一抗，HPR标记羊抗兔IgG为二抗，ECL显色，检测膜上特异性反应。

v型96孔板从1～12进行编号，每孔加生理盐水50 μL，分别将VSVΔG*-HA病毒液和禽流感 H6N2病毒液各50 μL分别加入96孔板第一孔，然后进行倍比稀释，并做阴性对照，每孔加1 %鸡红细胞50 μL摇匀后放置室温45 min观察结果。

构建好的重组质粒使用BamHI XhoI酶进行双酶切，经琼脂糖电泳跑胶鉴定与H6N2的HA片段和载体pcDNA3.1 + 长度相符，HA片段长1 713 bp，pcDNA3.1 + 为5 428 bp，总长度约为7 127 bp，双酶切条共有2个条带，位置分别在1 700与5 428 bp，结果与预期一致，说明质粒构建成功。

单感染VSV-ΔG*-G制备的病毒感染 293T细胞后无荧光表达，而pcDNA3.1HA转染293T 再感染 VSV-ΔG*-G 制备的假病毒感染293T细胞后存在荧光表达。

转染重组质粒pcDNA3.1HA后具有特异性HA条带，分子量大小75 kDa左右，大小与预期相符合，说明HA蛋白存在于假病毒中。

以PBS为阴性对照，VSV-ΔG*-HA假病毒和禽流感H6N2病毒与鸡红细胞作用引起红细胞凝集，H6N2病毒对照血凝效价达到2⁸，VSV-ΔG*-HA假病毒血凝效价达到 2⁵，而阴性对照未检测到凝血现象。

H6亚型AIVs属于低致病性禽流感病毒，一直未引起人们关注^[5]，直到1997年，香港首例人感染高致病性H5N1 AIVs的出现，且发现H5N1病毒的内部基因来源于香港地区的H6亚型AIVs^{[6 – 7]}。1965年从火鸡体内首次分离出H6亚型AIVs^[8]，2013年台湾发现全球首例人感染H6N1病例^{[9 – 10]}。这些均提示H6亚型病毒可以突破种属屏障而感染哺乳动物，甚至人类。

本研究以H6N2亚型为模板，构建成功H6N2型禽流感病毒HA蛋白的疱疹性口炎病毒。G蛋白决定着病毒的毒性，当缺失疱疹性口炎病毒的G蛋白时，病毒将会丧失感染性。故G蛋白在VSV感染细胞过程中起到了至关重要的作用。VSV-ΔG*-G病毒系统可与其它糖基化的蛋白在细胞内发生重组，形成具有糖蛋白生物学活性的重组假病毒^{[11 – 12]}。由于其与人或其他动物多种红细胞表面N – 乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集是流感病毒HA 蛋白的特征，通过鸡红细胞血凝试验来检验 VSVΔG*-HA假病毒是否也具有这个特质。结果表明，VSVΔG*-HA能够使鸡红细胞发生凝集，其血凝效价达到 2 ⁵，说明 VSVΔG*-HA假病毒具有与其来源H6N2型AIVs相似或相同的生物学功能。成功构建的 VSVΔG*-HA假病毒系统因安全性好，简便易行，且具有生物活性，为H6亚型禽流感的预防、诊断及治疗奠定了基础，也为该病毒的进一步研究提供了技术支持。