2. 大理大学农学与生物科学学院;
3. 大理大学东喜玛拉雅研究院;
4. 云南省高校洱海流域保护与可持续发展研究重点实验室;
5. 大理大学三江并流区域生物多样性保护与利用省创新团队
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类发酵糖类产生大量乳酸的无芽孢、革兰氏染色阳性的细菌统称,广泛分布于人体和动物的肠道及自然界中[1]。自19世纪中叶法国巴斯德首次发现乳酸菌,至今自然界中已发现乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、片球菌属(Pediococcus Claussen)等至少23个种属[2 – 3]。乳酸菌因具有特殊的生理功能(调节胃肠道菌群、降低血清胆固醇、缓解乳糖不耐症、增强机体免疫力等作用)和较大的商业价值,广泛运用于食品、轻工业、饲料及医药等行业[2, 4]。尽管人类安全使用乳酸菌作为传统发酵剂已经有上百年的历史,但随着人们发现微生物携带的耐药基因可借助质粒、转座子、整合子等可移动的遗传物质在致病菌和非致病菌之间发生水平转移[5],有研究者在酸奶和其他发酵食品中检测到乳酸菌携带红霉素、四环素和庆大霉素的耐药基因[6 – 9],且耐药基因可在不同菌株间发生转移[10]。越来越多的学者开始关注由乳酸菌的耐药性导致的食品安全问题,并有学者指出乳酸菌可能是构成人类健康威胁的耐药基因库[9, 11]。本研究以实验室前期研究从酸奶中分离纯化出的乳酸菌菌株作为实验菌株,测定不同诱导代次的菌株对4种抗生素(氨苄青霉素、氯霉素、硫酸庆大霉素、氨苄西林钠)的敏感性变化情况。
1 材料和方法 1.1 菌株实验菌株(1株保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和1株嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus))来源于本实验室保存的,分离自大理某品牌市售酸奶中的菌株;2株标准菌株:来自中国工业微生物菌种保藏中心(嗜热链球菌(S. thermophilus):CICC 6063,德氏保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus):CICC 6047)。
1.2 供试抗生素将配制好的抗生素:氨苄青霉素(ampicillin)0.1 g/mL,溶于无菌水;氯霉素(chloramphenicol)0.1 g/mL,溶于95 %的乙醇;硫酸庆大霉素(gentamycin sulfate)0.1 g/mL,溶于无菌水;氨苄西林钠(ampicillin sodium)0.1 g/mL,溶于无菌水;经0.22 μm的滤膜无菌过滤后备用(购自中国食品药品研究院)。参照常用质量浓度,用无菌水作100倍比稀释,选用其最终药物质量浓度为:1.0 × 10–2、1.0 × 10–4、1.0 × 10–6、1.0 × l0–8、1.0 × 10–10 mg/mL的溶液作为实验组。
1.3 培养基MC培养基、MRS培养基、乳酸菌培养基和脱脂乳培养基均按参考文献[12 – 14]配制,用于乳酸菌的活化及分离纯化;含抗生素培养基的配制:在超净工作台中,取1 mL配制好的不同浓度的抗生素溶液加入到15 mL MRS液体培养基中,每个质量浓度均设3个平行,并设立无菌水空白对照组。每种抗生素培养基的配制方法相同。
1.4 药敏纸片抗生素药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司,每片直径为6.5 mm,质量完全符合WHO标准规定。目前乳酸菌对抗生素的耐药性判定尚缺乏统一的标准,在本研究中乳酸菌对氨苄青霉素、氨苄西林钠、硫酸庆大霉素和氯霉素的抑菌圈直径解释参照美国临床和实验室标准化协会CLSI 2017版(Clinical and Laboratory Standards Institute)中肠杆菌属的标准[15]。
1.5 实验方法 1.5.1 菌株耐药诱导于装有15 mL MRS液体培养基试管中,添加不同浓度药物,使得最终浓度分别为:1.0 × 10–2、1.0 × 10–4、1.0 × 10–6、1.0 × l0–8、1.0 × 10–10 mg/mL,再加入200 μL,浓度为OD600 nm = 0.5的菌液,混匀,37 ℃静置培养24 h后,取200 μL菌液转接至新的含有等浓度药物的MRS培养基中继续耐药诱导培养,连续转接5次,每次诱导结束后分离菌株进行耐药情况分析。同时,设置无菌水为空白对照组。
1.5.2 耐药情况分析不同诱导代次分离所得菌株耐药情况分析,实验过程为:所得药物诱导的菌株分别划线接种至MRS固体培养基,37 ℃培养48 h后,刮取菌苔制备成菌悬液,并以无菌水调整菌液浓度至OD600 nm = 0.5后,取菌液200 μL至MRS固体培养基,用无菌涂布器将菌液均匀涂开,待培养基上的菌液略干后,以无菌操作取出药敏纸片,贴于接好同种药物诱导的乳酸菌的平板内,各纸片中心相距大于24 mm,纸片距平板内缘大于l5 mm,每皿贴3个纸片,每菌株重复实验3次,同时设空白药敏纸片为对照。室温放置0.5 h,然后置于37 ℃培养,24 h后用精确度为1 mm的刻度尺测量并记录抑菌圈直径,最终结果以
试验数据采用SPSS 17软件进行统计分析,结果以
经1.0 × 10–2 mg/mL的氨苄青霉素、氯霉素和硫酸庆大霉素连续诱导培养的不同代次保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus),使用同种药物的药敏纸片进行耐药情况测定时发现,其抑菌圈直径均大于其他浓度诱导组;经1.0 × 10–2和1.0 × 10–4 mg/mL氨苄西林钠连续诱导培养1、2和3代的保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus),抑菌圈直径大于其他浓度组,但在第4次传代及其之后的诱导培养中,整个平板内无菌生长,详见图1。经1.0 × 10–2 mg/mL氨苄青霉素、氯霉素和硫酸庆大霉素诱导的保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus)对其表现为敏感,其余浓度氯霉素和氨苄青霉素诱导的保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus)对其均表现出耐药,其余浓度硫酸庆大霉素诱导的保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus)对其表现为部分耐药,而除了1.0 × 10–8和1.0 × 10–10 mg/mL氨苄西林钠诱导的1代保加利亚乳酸杆菌对其表现为耐药,其余浓度诱导组均表现为敏感,详见表1、2。经1.0 × 10–2 mg/mL氨苄青霉素诱导的保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus),其抑菌圈直径随着传代次数的增加而减小(r = – 0.84,P < 0.05),见 图1 b,而在1.0 × 10–10 mg/mL氨苄西林钠的诱导下,氨苄西林钠对保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus)抑菌圈直径,随着传代次数的增加随之增大(r = 0.96,P < 0.05),详见 图1 a。
2.2 嗜热链球菌(S. thermophilus)耐药诱导结果(图2,表1、2)高浓度(1.0 × 10–2 mg/mL)氨苄青霉素、氯霉素和硫酸庆大霉素连续诱导的嗜热链球菌(S. thermophilus),经同种药物的药敏纸片进行耐药情况测定时发现:其抑菌圈直径明显高于其他浓度诱导组,经氨苄西林钠(1.0 × 10–2 、1.0 × 10–4 mg/mL)耐药诱导培养的嗜热链球菌(S. thermophilus)在培养1代之后的传代中整个平板内均无菌生长。高浓度(1.0 × 10–2 mg/mL)氨苄青霉素、氯霉素和硫酸庆大霉素连续诱导的嗜热链球菌(S. thermophilus)对同种药物均表现为敏感,而经低浓度(1.0 × 10–4~1.0 × 10–10 mg/mL)浓度氨苄青霉素耐药诱导的嗜热链球菌(S. thermophilus)对其均表现为耐药,硫酸庆大霉素、氯霉素诱导的嗜热链球菌(S. thermophilus)对其表现部分耐药,1.0 × 10–6~1.0 × 10–10 mg/mL氨苄西林钠诱导培养的嗜热链球菌(S. thermophilus)对氨苄西林钠表现为部分耐药,详见表1、2。经1.0 × 10–6 mg/mL氨苄青霉素诱导的嗜热链球菌(S. thermophilus),其抑菌圈直径随着传代次数的增加而减小(r = – 0.98,P < 0.05),见 图2 b,而经1.0 × 10–10 mg/mL浓度氨苄西林钠耐药诱导的嗜热链球菌(S. thermophilus),其抑菌圈直径随着传代次数的增加随之增大(r = 0.82,P < 0.05),详见 图2 a。
2.3 2种乳酸菌耐药诱导情况比较(表1、2)相同药物,相同浓度,相同代次比较显示,嗜热链球菌(S. thermophilus)对3种抗生素(氨苄青霉素、硫酸庆大霉素、氯霉素)的敏感性明显高于保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus),具体表现为:经1.0 × l0–10 mg/mL氨苄青霉素诱导的保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus)对其表现为耐药,而经同浓度的氨苄青霉素诱导培养的第3代及其后代次的嗜热链球菌(S. thermophilus)均无生长。经1.0 × l0–4和1.0 × l0–6 mg/mL硫酸庆大霉素诱导培养的第4、5代的嗜热链球菌(S. thermophilus)对其表现为敏感,而保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus)表现为耐药。经1.0 × l0–6~1.0 × l0–10 mg/mL氯霉素诱导的第4代嗜热链球菌(S. thermophilus)对其均表现为敏感,而保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus)对其表现耐药,详见表1、2。
3 讨 论经低浓度(1.0 × 10–4~1.0 × 10–10 mg/mL)氨苄青霉素耐药诱导的2种乳酸菌对其表现出完全耐药,经硫酸庆大霉素和氯霉素诱导的2种乳酸菌对其表现为部分耐药,表明低浓度使用同种抗生素易诱导乳酸菌产生耐药性。在本研究中发现经1.0 × 10–2和1.0 × 10–6 mg/mL浓度氨苄青霉素诱导培养的保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus)和嗜热链球菌(S. thermophilus)对其抑菌圈直径随着乳酸菌传代次数的增加而减小,耐药性明显。Aslim[16]分离出34株嗜热链球菌(S. thermophilus)对青霉素表现出耐药性,耐药率为64 %,Yuksekdag[17]等分离24株乳酸菌对氨苄西林耐药率为56 %,张宏梅[18]从酸奶中分离的保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus)和嗜热链球菌(S. thermophilus)均对氨苄青霉素表现出耐药,张爱民从不同来源的样品分离的45株乳酸菌对氯霉素的耐药率为24.2 %[19]。以上均表明在抗生素的长期选择压力下,被认为最安全的食用乳酸菌也会产生获得性耐药,人类长期低剂量摄入含抗生素的奶制品,会导致超敏反应、肠道菌群失调,增加致病菌的治愈难度,加大了耐药基因扩散范围[20 – 21],且氨苄青霉素为人兽共用抗生素,乳酸菌对其耐药,会加速细菌耐药性的产生,甚至可能进一步加快耐药基因的扩散速度。
低浓度(1.0 × 10–10 mg/mL)氨苄西林钠诱导培养的两种乳酸菌均随着乳酸菌传代次数的增加,抑菌圈直径随之增大,即乳酸菌对氨苄西林钠的敏感性随着传代次数的增加而增加,吕耀龙等人[22]从牛乳中分离的16株乳酸菌对氨苄西林的耐药率均为0,杨吉霞等人[23]也曾报道乳酸菌对氨苄西林钠具有较强的敏感性(敏感率为74.4 %),与本研究结果一致,表明乳酸菌对氨苄西林钠的敏感性较强。虽然氨苄青霉素和氨苄西林钠的作用机制相同,但两种乳酸菌对两种抗生素的敏感性是不同的,表明同种乳酸菌对同类的不同种抗生素的敏感性也会有所不同,周宁等人[24]也发现乳酸菌对青霉素G的敏感性大于氨苄青霉素,左瑞雨等人[25]研究结果与本研究相似,提示在微生态制剂选用菌株时,必须充分考虑乳酸菌对同种作用机制抗生素的敏感性差异性,合理选择抗生素,必要时进行药敏实验。
在本研究中,虽经硫酸庆大霉素和氯霉素诱导培养的保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus)和嗜热链球菌(S. thermophilus)的抑菌圈直径与乳酸菌的传代次数无相关关系,但在低浓度(1.0 × 10–4~1.0 × 10–10 mg/mL)硫酸庆大霉素和氯霉素诱导培养的乳酸菌对其均表现出耐药,且周宁[24]和Zhou[26]等研究曾发现乳酸菌对氯霉素存在耐药性,秦宇轩[6]、石磊[27]等人从酸奶中分离的乳酸菌对庆大霉素耐药率分别为100 %、50 %。另研究表明无耐药表型的抗生素,也可存在耐药基因不表达或表达不充分的情况[8, 28],故氯霉素和硫酸庆大霉素的耐药性问题不容忽视,需加强监测。
此外,本实验发现在相同药物,相同浓度,相同代次的情况下,嗜热链球菌(S. thermophilus)对3种抗生素的敏感性明显高于保加利亚乳酸杆菌(L. bulgaricus),其形成原因有待在未来的研究中探索。
相对于“瘦肉精”、“三聚氰胺奶粉”、“速成鸡”、“红心蛋”等一系列近年来已经广为人知的食品安全事件,乳酸饮料中的抗生素残留及与之相关的乳酸菌耐药的问题较为隐匿,目前尚未引起广大消费者的关注。本研究结果表明:酸奶中的乳酸菌存在耐药问题,不同代次的两种乳酸菌对不同抗生素的敏感性不尽相同,其敏感性高低与乳酸菌生长繁殖过程中接触抗生素的频率有关。因此,原料乳中抗生素残留的检测及乳酸菌耐药基因监测是保证乳酸饮料食品安全的必要措施之一。如何控制奶牛养殖中抗生素的使用,即养殖卫生人员熟悉抗生素的抗菌谱和遵守休药期规范,合理使用抗生素并进行病牛监测,避免抗生素残留乳和耐药菌种进入产业链,方能减少酸奶中抗生素残留及乳酸菌耐药问题。
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