肺癌是常见的恶性肿瘤，据统计每年肺癌新发病例大约有180万人，导致160万人死亡，占男性癌症相关死亡的第1位和女性癌症相关死亡的第2位^[1]。肺癌包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占85 %左右^[2]。相对于小细胞肺癌，非小细胞肺癌对化疗不敏感，在病情允许的情况下，手术切除是主要的治疗手段，手术前和术后辅助化疗也是重要的治疗方法^{[3 – 4]}。在手术中使用的麻醉药或止痛药可能通过调节免疫系统，炎症和血管生成，对癌细胞有直接作用，从而影响癌症的发展^{[5 – 7]}。挥发性的麻醉药和阿片类展示出促进癌症的作用，而异丙芬和非甾体类化合物主要有抗肿瘤的作用^{[8 – 9]}。维库溴铵属于非甾体类化合物，是临床手术中常用的肌肉松弛剂。研究发现，维库溴铵能降低A549细胞存活，抑制细胞侵袭^[10]。本研究以体外培养的人非小细胞肺癌A549细胞为研究对象，探讨维库溴铵对A549细胞增殖和转移能力的影响及机制，结果报告如下。

非小细胞肺癌A549细胞株（美国ATCC公司）；维库溴铵（纯度 > 98 %，上海波以尔化工有限公司）；杜氏高糖培养基（Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM）和胎牛血清（美国Gibco公司）；细胞计数试剂盒（CCK-8）（北京索莱宝生化试剂有限公司）；Hoechst染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；抗体磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、蛋白酶B（protein kinase B，AKT）、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR、低氧诱导因子-1α（ hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α）（英国Abcam公司）。

A549细胞接种于含10 %胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37 ℃、5 %CO₂、饱和湿度。当细胞密度达80 %～90 %时进行传代，取对数生长期的细胞用于实验。

取对数生长期A549细胞，消化为单细胞悬液，调整细胞密度至1 × 10⁵个/mL，96孔板中每孔加100 μL单细胞悬液，37 ℃、5 %CO₂饱和湿度中培养4 h，待细胞贴壁后，相应的孔中加10 μL不同浓度的维库溴铵（0～50 μg/mL），每组设置3个复孔，其中0为对照组，继续培养24 h。向孔中加10 μL的CCK-8溶液，培养箱中孵育2 h后，检测450 nm处吸光度（A）值。根据细胞活力确定后续实验剂量设计。

采用CCK-8法，将A549细胞分为对照组、维库溴铵低、中、高剂量组（10、15、20 μg/mL）；向96孔板中加100 μL单细胞悬液，细胞贴壁后加10 μL相应浓度的维库溴铵，于24、48、72和96 h时向孔中加10 μL的CCK-8溶液，培养箱中孵育2 h后，测450 nm处吸光度（A）值。计算细胞增殖倍数。

采用Hoechst染色法，用75 %的乙醇浸泡洁净盖玻片5 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗3次，将盖玻片置于6孔板内。将A549细胞分为对照组、维库溴铵低、中、高剂量组（10、15、20 μg/mL）；接种对数生长期的细胞，加相应浓度的维库溴铵，培养48 h后，弃培养基，加固定液室温下固定10 min，弃固定液，用PBS洗2次，每次3 min。加0.5 mL Hoechst 33258溶液，染色5 min，加PBS洗3次，每次3 min。加抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察，随机选择5个视野计数并拍照。

利用体外侵袭实验，用无血清的DMEM培养基将Matrigel按照6 : 1稀释后，取200 μL至上室，4 ℃风干；取对数生长期的A549细胞，用0.25 %胰酶消化细胞，用含0、10、15、20 μg/mL维库溴铵的无血清培养基将细胞密度调整为1 × 10⁵个/mL，取200 μL的细胞悬液接种于Transwell上层小室，下层小室加含10 %胎牛血清的完全培养基。在37 ℃、5 % CO₂的培养箱中培养24 h后取出小室，用棉签擦去基质和上层细胞；4 %多聚甲醛固定15 min，在滤膜上加几滴吉姆萨染液，反应10 min，蒸馏水洗后，倒置显微镜下随机选择5个400倍视野观察计数并拍照，每组设置6个复孔。

采用划痕实验，对数生长期的A549细胞接种于24孔板，当细胞密度达90 %左右时，用10 μL枪尖垂直于底部划5条平行直线，PBS洗细胞碎片和悬浮的细胞。加入含0、10、15、20 μg/mL维库溴铵的无血清培养基，继续培养24 h。在0和24 h时于倒置显微镜下观察并拍照，使用软件Image J分析划痕面积。划痕闭合率 =（0 h划痕面积 – 24 h划痕面积）/（0 h时划痕面积）× 100 %。

采用蛋白质印迹法，取对数生长期的A549细胞，0、10、15、20 μg/mL维库溴铵作用48 h后，收集细胞，PBS洗2次，加蛋白酶抑制剂和裂解液，冰上静置30 min，离心收集上清，测蛋白浓度后，加蛋白上样缓冲液调平，沸水浴10 min，每孔上样30 μg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5 %脱脂牛奶室温下封闭1 h，将膜转至一抗中4 ℃孵育过夜，TBST（Tris buffer saline with tween）洗10 min × 3次，加二抗室温下孵育2 h，TBST洗10 min × 3次，成像系统中显影。使用软件ImagePro plus 6.0分析蛋白条带灰度值，以甘油醛3 – 磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。

数据以 $\bar x$ ± s表示，采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，多组间比较使用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

图 1

图 1 维库溴铵对A549细胞毒性作用观察

使用不同浓度维库溴铵处理A549细胞后，结果显示，当维库溴铵浓度大于20 μg/mL时，细胞活性明显降低；维库溴铵浓度 < 20 μg/mL时，细胞活力无明显下降。故后续实验采用10、15、20 μg/mL剂量。

图 2

注：与对照组比较，a P < 0.01。 图 2 维库溴铵对A549细胞增殖倍数影响

低、中、高剂量维库溴铵作用于A549细胞96 h后，结果显示，与对照组比较，维库溴铵低、中、高剂量组细胞增殖倍数明显降低，具有明显剂量效应关系。

图 3

注：A对照组；B、C、D维库溴铵10、15、20 μg/mL组。 图 3 维库溴铵对A549细胞凋亡影响（Hoechst染色）

结果显示，对照组、维库溴铵低、中、高剂量组A549细胞凋亡率分别为（3.9 % ± 0.5）%、（6.2 % ± 0.8 %）、（8.9 % ± 1.1 %）、（16.3 % ± 1.0 %）；与对照组比较，维库溴铵中、高剂量组A549细胞凋亡率明显上升。提示，维库溴铵可诱导A549细胞凋亡。

图 4

注：A对照组；B、C、D维库溴铵10、15、20 μg/mL组。 图 4 维库溴铵对A549细胞侵袭能力影响（Transwell）

结果显示，对照组、维库溴铵低、中、高剂量组A549细胞单视野下侵袭细胞数目分别为（152 ± 11）、（105 ± 9）、（68 ± 7）、（42 ± 5）个；与对照组比较，维库溴铵低、中、高剂量组A549细胞侵袭能力明显降低。提示，维库溴铵可抑制A549细胞侵袭能力。

图 5

注：A对照组；B、C、D维库溴铵10、15、20 μg/mL）组；A/B/C/D组在0 h测量，A1/B1/C1/D1在24 h时测量。 图 5 维库溴铵对A549细胞迁移能力影响（划痕实验）

结果显示，对照组、维库溴铵低、中、高剂量组A549细胞划痕闭合率分别为（76.3 ± 5.6）%、（56.1 ± 5.1）%、（39.2 ± 4.8）%、（26.1 ± 4.5）%；与对照组比较，维库溴铵低、中、高剂量组A549细胞迁移能力明显降低。提示，维库溴铵可抑制A549细胞迁移能力。

图 6

注：1 对照组；2～4维库溴铵10、15、20 μg/mL组。 图 6 维库溴铵对A549细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白表达影响

表 1

表 1 维库溴铵对A549细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白表达影响（ $\bar x$ ± s，n = 3） 组别（μg/mL） PI3K p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR HIF-1α 对照组 0.91 ± 0.06 0.87 ± 0.09 0.81 ± 0.13 0.85 ± 0.09 维库溴铵 10 0.78 ± 0.05a 0.73 ± 0.11a 0.75 ± 0.10a 0.74 ± 0.06a 　　　　 15 0.62 ± 0.06a 0.58 ± 0.09a 0.66 ± 0.08a 0.66 ± 0.07a 　　　　 20 0.35 ± 0.05a 0.38 ± 0.09a 0.36 ± 0.10a 0.35 ± 0.04a 　　注：与对照组比较，a P < 0.01。

表 1 维库溴铵对A549细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白表达影响（ $\bar x$ ± s，n = 3）

结果显示，维库溴铵作用于A549细胞后，细胞中磷酸化PI3K表达水平均明显降低；总AKT表达水平无明显变化，但磷酸化AKT表达水平明显降低，进而p-AKT/AKT降低；磷酸化mTOR表达降低，p-mTOR/mTOR比值降低；HIF-1α 表达水平明显降低。

表 2

表 2 740Y-P对A549细胞PI3K通路影响（ $\bar x$ ± s，n = 3） 组别（μg/mL） PI3K p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR HIFα 对照组 0.48 ± 0.09 0.45 ± 0.08 0.46 ± 0.10 0.48 ± 0.09 维库溴铵 20 0.18 ± 0.04a 0.15 ± 0.06a 0.19 ± 0.06a 0.15 ± 0.04a 740Y-P 0.86 ± 0.13a 0.83 ± 0.10a 0.84 ± 0.09a 0.81 ± 0.14a 维库溴铵 20 + 740Y-P 0.56 ± 0.08b 0.51 ± 0.08b 0.53 ± 0.11b 0.56 ± 0.08b 　　注：与对照组比较，a P < 0.01；与740Y-P组比较，b P < 0.01。

表 2 740Y-P对A549细胞PI3K通路影响（ $\bar x$ ± s，n = 3）

表 3

表 3 740Y-P对A549细胞增殖和转移能力影响 组别（μg/mL） 细胞增殖倍数 细胞凋亡率（%） 侵袭数目（个） 划痕闭合率（%） 24 h 48 h 72 h 96 h 对照组 1.46 ± 0.20 3.35 ± 0.35 4.93 ± 0.39 5.51 ± 0.42 4.9 ± 1.1 119 ± 12 68.2 ± 5.8 维库溴铵 20 1.23 ± 0.28a 2.31 ± 0.29a 3.08 ± 0.37a 3.32 ± 0.38a 19.6 ± 2.3a 38 ± 5a 21.5 ± 4.9a 740Y-P 1.92 ± 0.21a 4.19 ± 0.36a 6.21 ± 0.45a 7.13 ± 0.46a 2.8 ± 0.7a 165 ± 15a 92.3 ± 6.1a 维库溴铵 20 + 740Y-P 1.41 ± 0.23b 3.23 ± 0.33b 4.56 ± 0.41b 5.06 ± 0.49b 7.1 ± 1.2b 113 ± 10b 61.4 ± 5.3b 　　注：与对照组比较，a P < 0.01；与740Y-P组比较，b P < 0.01。

表 3 740Y-P对A549细胞增殖和转移能力影响

向A549细胞中添加PI3K的激活剂740Y-P后，PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和HIF-1α 水平均明显升高（表2）；与740Y-P组比较，维库溴铵 + 740Y-P组PI3K、HIF-1α 表达水平明显降低，p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值也明显降低。

肺癌是世界上发病率和死亡率均处于高位的恶性肿瘤，非小细胞肺癌占肺癌总数的85 %。与其他类型肺癌相比，非小细胞肺癌对化疗耐受能力、侵袭和迁移能力更强。维库溴铵是临床上常用的麻醉药，竞争性结合胆碱受体，在人体静脉使用浓度约为0.1 mg/kg。细胞增殖异常和凋亡受抑是恶性肿瘤细胞无限增殖的主要原因。在手术期间，肿瘤的发展与血管生成、过度炎症反应和强烈的免疫抑制相关^{[11 – 12]}。许多促进炎症的介质，如前列腺类化合物，能诱导上皮细胞增殖，促进血管生成，抑制细胞凋亡^[13]。本研究结果显示，维库溴铵可抑制A549细胞增殖，诱导细胞凋亡。

由于非小细胞肺癌对化疗不敏感，且侵袭性强，导致肺癌患者5年生存率低；有效抑制非小细胞肺癌侵袭和迁移是相关研究的重点。本研究结果显示，维库溴铵处理A549细胞后，发生侵袭的细胞数目明显减少，划痕闭合率明显降低。提示，维库溴铵可抑制A549细胞的转移能力。磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路在细胞生长、存活、凋亡、血管生成和自噬等过程中发挥着重要作用。该通路活化后可以通过多种机制促进肿瘤的发生和发展^[14]。研究证实，在A549细胞中抑制PI3K/AKT通路的激活，能抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移^{[15 – 16]}。本研究结果显示，维库溴铵可抑制A549细胞中PI3K、p-AKT和p-mTOR表达水平。提示，维库溴铵可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活。

HIF是广泛表达的转录因子，能直接影响大约800个基因，使细胞适应生理环境变化^[17]。细胞中HIF水平升高主要受PI3K/AKT/mTOR通路和HIF降解通路的抑制来调节^[18]。研究发现挥发性麻醉药异氟烷能上调肾癌细胞中HIF的表达，从而促进肿瘤细胞增殖和恶性化^[19]。本研究结果显示，维库溴铵可抑制A549细胞中HIF-1α 表达，而PI3K激活剂促进HIF-1α 表达。提示，维库溴铵通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活，抑制HIF-1α 表达，进而影响A549细胞的生物学特征。

综上所述，维库溴铵可抑制人非小细胞肺癌（A549）细胞的增殖和转移，其机制可能与抑制PI3K-AKT通路的激活有关。