糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）引起的严重并发症，也是糖尿病致残和死亡重要原因，发病机制比较复杂^{[1 – 2]}，至今仍未完全阐明，遗传因素、糖代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激、细胞及炎症因子^[3]等多种因素均可能参与其发生发展过程。研究发现使用糖原合成酶激酶 – 3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）抑制剂后，核转录因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）的mRNA与蛋白表达显著下降，NF-κB通路活性降低，相关炎性因子减少，可缓解DKD肾脏的病理病变 ^[4]。在破骨细胞中骨保护素（osteoprotegerin，OPG）作为一种可溶性诱导受体，可与核因子 κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK）竞争性结合RANK配体（receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL），阻断RANKL与RANK的结合，抑制其生理效应的发挥，在破骨细胞分化、发育和成熟过程中起关键作用^{[5 – 7]}。研究表明氯化锂可以调节糖代谢、影响上皮 – 间质转分、参与胰岛素抵抗从而预防糖尿病肾脏病发生 ^[8]。因此，本研究使用GSK-3β 抑制剂氯化锂抑制GSK-3β 活性，观察DKD大鼠肾组织中 β-catenin和OPG表达水平变化，旨在探讨GSK-3β 对糖尿病肾脏病大鼠肾组织中OPG相关通路的调控作用及意义。

722E型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司），LDIS-2型低温离心机（北京医用离心机厂），血糖分析仪（深圳市鑫台欣公司），Gel Doc EQ型DNA成像分析仪（美国BIO-RAD公司），TC-512型梯度PCR扩增仪（英国TECHNE公司），光学显微镜（日本OLYMPUS公司），梯度PCR扩增仪（德国Eppendorf公司），DYY-Ⅲ-5型稳流电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂），病理摄像及分析系统（JD-801计算机图像分析系统）、BX41图像采集系统（日本OLYMPUS公司）。链脲佐菌素（streptozocin，STZ）（美国Sigma公司），OPG抗体（美国BioVision生物试剂公司），β-catenin抗体（加拿大Sigma-Aldrich有限公司），RT-qPCR试剂盒（加拿大Qiagen有限公司），PCR引物设计及合成（上海捷瑞生物工程有限公司）。

45只健康SD大鼠（体重200～250 g），由贵州省实验动物工程技术中心提供，生产许可证号：SYXK（黔）2012 – 0001，给予普通饲料适应性喂养2周后，随机选择15只，作为对照组，其余30只禁食后，按55 mg/kg腹腔一次性注射STZ溶液制备糖尿病模型，对照组大鼠腹腔注射相同体积溶剂（柠檬酸 – 柠檬酸三钠缓冲液）。3 d后静脉取血，血糖 > 16.7 mmol/L者确定为糖尿病模型 ^[9]成功。各组大鼠继续喂养10周，每周称重、测血糖。10周后禁食（不禁水）24 h，测定24 h尿蛋白含量，24h尿蛋白 ≥ 30 mg或超过对照组尿蛋白10倍，作为糖尿病大鼠早期DKD标准^[10]。

将30只DKD造模成功大鼠随机分为模型组（15只）和氯化锂干预组（15只）。氯化锂干预组大鼠腹腔注射氯化锂（LiCl）15 mg/kg，隔天1次，连续10 d；模型组和对照组大鼠给予同等体积生理盐水腹腔注射。腹腔注射12 d后处死大鼠，处死大鼠前1天代谢笼收集24 h尿样本，肾脏按常规制成3 μm病理切片行苏木精 – 伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色、免疫组化检测。

采用考马斯亮蓝法测定大鼠24 h尿蛋白浓度，采用血糖仪检测大鼠血糖水平。

颈椎脱臼法处死大鼠，解剖、分离双侧肾脏，去除包膜，右肾用生理盐水冲洗后，固定，4 ℃保存，用于HE染色及免疫组化检测。左肾置于冰盒中，– 80 ℃低温冰箱保存，用于实时荧光定量PCR检测。3 μm肾组织石蜡切片，5 ℃烤箱内烤片10 min，脱蜡，切片置于二甲苯中浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min，水洗，放入1 %苏木素染液中染色5 min，自来水冲洗反蓝及1 %的盐酸酒精分色，再放入0.5 %伊红染色液中染色2～3 min，自来水冲洗后放入双蒸水，脱水，中性胶封片。显微镜观察大鼠肾组织肾小球、肾小管、间质等的形态结构变化。

采用免疫组化法，肾组织石蜡切片，烤片、脱水，磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗后，0.01 mol/L柠檬酸修复液（pH 6.0）微波修复10 min，冷却至室温，PBS洗后用3 %过氧化氢室温下孵育20 min，PBS洗后滴加1 : 100稀释的一抗摇床50 min，PBS洗后滴加过氧化物酶标记二抗，20～37 ℃孵育60 min，PBS冲洗后二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，冲洗，苏木素复染2 min，盐酸酒精分化，脱水、透明、封片，镜检。采用全自动图像分析系统分析免疫组化结果，光学显微镜200倍视野下，每张切片随机选择8个视野，测定肾小管/球阳性免疫组化染色的灰度值，计算相对表达量。

采用实时荧光定量PCR（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）法，用Trizol试剂盒抽提各组大鼠肾组织总RNA，进行逆转录。OPG F：5′-ATAAAGGCATGCAAACCCAG-3′，R：5′-GCCTCAAGTGCCTGAGAAAC-3′，扩增片段长度341 bp；RANKL F：5′-GCTCACCTCACCATCAATGCT-3′，R：5′-GGTACCAAGAGGACAGACTGACTTTA-3′，片段长度497 bp；β-actin F：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，R：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，片段长度186 bp。Real-time PCR循环条件为：93 ℃ 3 min, 92.5 ℃ 48 s，55 ℃ 1 min，40个循环。以Applied Biosystems SDS 14.0软件进行荧光收集和数据分析。

计量数据以 $ \bar x \pm s$ 表示，采用SPSS 20.0软件进行统计分析，正态分布计量资料两两比较采用t检验，3组间比较采用单因素方差分析，方差齐时用SNK检验，方差不齐用Tamhane′s检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

表 1

表 1 氯化锂干预对DKD大鼠体重、血糖、24h尿蛋白水平影响（ $ \bar x \pm s$ ，n = 15） 组别 体重（g） 血糖值（mmol/L） 尿蛋白（g/24h） 对照组 489.77 ± 49.86 10.67 ± 2.10 14.72 ± 3.37 模型组 254.08 ± 24.74 a 22.63 ± 2.08 a 154.17 ± 20.65 a 氯化锂干预组 298.27 ± 18.71 b 17.98 ± 1.09 b 107.20 ± 31.15 b 　　注：与对照组比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05。

表 1 氯化锂干预对DKD大鼠体重、血糖、24h尿蛋白水平影响（ $ \bar x \pm s$ ，n = 15）

糖尿病造模后（第4周末），模型组大鼠出现不同程度多尿、多饮、多食、消瘦，活动减少；DKD造模后（第10周末），与对照组比较，模型组、氯化锂干预组大鼠体重降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，氯化锂干预组大鼠体重升高，差异有统计学意义（ P < 0.05）。与对照组比较，模型组大鼠血糖与24 h尿蛋白水平明显升高（ P均 < 0.05）；与模型组比较，氯化锂干预组大鼠血糖与24 h尿蛋白水平下降（ P均 < 0.05）。

图 1

注：A对照组；B模型组；C氯化锂干预组。 图 1 氯化锂对DKD大鼠肾组织病理学影响（HE，× 400）

结果显示，对照组大鼠肾小球大小均一，小管上皮细胞完整，基底膜薄，管周无纤维化及明显的间质水肿（图1A）；模型组大鼠肾组织中肾小球肥大，系膜基质增多，毛细血管基底膜增厚；肾小管基底膜增厚，管腔狭窄（图1B）；氯化锂干预组大鼠肾小球体积稍增大、毛细血管基底膜轻度增厚、系膜基质增生、肾小管上皮细胞变性程度较模型组有所减轻（图1C）。

图 2

注：A对照组；B模型组；C氯化锂组。 图 2 氯化锂对DKD大鼠肾组织 β-catenin、OPG表达影响（免疫组化，× 200）

表 2

表 2 氯化锂对DKD大鼠肾组织 β-catenin、OPG表达影响（ $ \bar x \pm s$ ，n = 15） 组别 β-catenin OPG 对照组 1.0 ± 0.00 1.0 ± 0.00 模型组 2.2 ± 0.31a 1.97 ± 0.15a 氯化锂干预组 2.0 ± 0.20a 1.62 ± 0.21a 　　注：与对照组比较，a P < 0.05。

表 2 氯化锂对DKD大鼠肾组织 β-catenin、OPG表达影响（ $ \bar x \pm s$ ，n = 15）

β-catenin阳性表达部位在肾小管和肾小球的胞浆及胞核，呈黄染颗粒状。对照组大鼠肾小管上皮细胞胞浆内 β-catenin呈中度表达，胞核内未见表达（图2A）；模型组大鼠肾小管上皮细胞胞浆内 β-catenin有部分表达，但胞核内未见表达（图2B）；氯化锂干预组大鼠肾组织细胞胞浆内 β-catenin有表达，且核浆可见表达（图2C）。OPG阳性部位在肾小球和肾小管胞浆及胞核，呈黄染颗粒状。对照组胞浆及胞核可见少量阳性表达（图2A）；与对照组比较，模型组与氯化锂干预组大鼠肾小管上皮细胞胞浆内OPG表达均有增强（P < 0.05）（ 图2B、C）。

与对照组（1.00 ± 0.00）比较，模型组大鼠肾组织OPG/RANKL mRNA表达（0.6 ± 0.06）明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）：与模型组比较，氯化锂干预组大鼠肾组织中OPG/RANKL mRNA表达（1.6 ± 0.12）明显升高，差异有统计学意义（ P < 0.05）。

糖尿病患者中约有30 %～40 %的比例会出现肾脏损害，即糖尿病肾病（DKD），是导致终末期肾病和死亡的主要原因。目前，认为是多因素如糖代谢紊乱^[11]、血流动力学改变^[12]，炎症因子^{[13 – 14]}等综合作用下的结果。研究发现，GSK-3β 可促进高糖及胰岛素诱导的肾上皮细胞外基质蛋白合成，在DKD肾脏肥大及细胞外基质聚集中发挥着重要作用，GSK-Wnt信号通路在DKD肾小管损伤中发挥重要作用^[15]。Wnt信号通路与细胞生长、分化、行使功能、凋亡等有关，该通路可通过OPG/RANKL/RANK信号通路的Cross-Talk来调节骨重建过程^[16]。通过增加OPG/RANKL比例，β-catenin可抑制破骨细胞的合成^[17]。NF-κB是一种广泛存在于各种细胞中的转录因子，在鼠破骨细胞中，NF-κB信号通路上关键细胞因子RANKL刺激能活化NF-κB信号通路^[18]，RANKL信号经过RANK传递给肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNFR-associated factors 6，TRAF6），TRAF6可通过NIK（NF-κB可诱导性激酶）和IKK（NF-κB激酶诱导剂）活化NF-κB^{[19 – 20]}，活化的NF-κB转位到核内与其相关的DNA序列结合以诱导多种前炎性细胞因子的转录，是炎症发生发展的重要因子。前期研究发现DKD与NF-κB信号通路的炎症反应具有一定关系^[4]，同时发现DKD大鼠肾组织中RANK表达显著上升。提示，RANK参与了DKD疾病进程。

本研究结果显示，糖尿病肾病模型组大鼠血糖及尿蛋白水平均高于对照组，OPG/RANKL mRNA比值减小，模型组大鼠肾组织病理变化明显；与模型组比较，氯化锂干预组（GSK-3β 抑制剂）大鼠血糖及尿蛋白水平均明显降低，肾组织中OPG/RANKL mRNA比值增大，大鼠肾组织病理改变减轻。其机制可能与下列过程有关：DKD大鼠肾组织中，虽然OPG呈保护性上升，但RANKL活化表达上升幅度更大，相对下调了OPG/RANKL mRNA比值；而在NF-κB信号通路中，过量上游因子RANKL的刺激活化下游NF-κB，促进DKD病程；而GSK-3β 抑制剂氯化锂在不同程度上激活了wnt/β-catenin信号通路，引起 β-catenin不同程度活化，上调了OPG/RANKL mRNA比值，即OPG表达相对上升，OPG作为RANK的竞争性因子，与RANKL结合，抑制了RANK/RANKL引起的NF-κB活化，一定程度上缓解了DKD的疾病进程。

综上所述，OPG可通过OPG/RANKL/RANK信号通路减缓糖尿病肾病的发生发展。因此，OPG可作为一个潜在的细胞因子治疗靶点，发挥对DKD大鼠肾脏的保护作用。