胶质瘤约占所有原发性恶性脑肿瘤的50％，虽然其发病率相对较低，但预后较差且对患者生活质量和认知功能产生不良影响，是临床治疗的难点和重点^[1]。多巴胺是一种重要的儿茶酚胺神经递质，通过与多巴胺受体结合在其靶器官中发挥调节情感、认知及外周血管等作用^[2]。目前对于情感认知、性格类型与癌症发生风险的关系尚存在争议，但有研究表明，长期服用抗多巴胺药物的精神病患者发生癌症的风险增加，而抗精神病多巴胺受体拮抗剂可抑制癌症干细胞分化，增加癌症干细胞对化学治疗剂的敏感性，发挥抗癌作用^{[3 – 4]}。最近研究表明，多巴胺通过影响血管生成和肿瘤细胞增殖在宫颈癌、乳腺癌等发生发展过程中发挥调节肿瘤生物学行为的作用^[5]。但目前关于多巴胺在胶质瘤治疗中的作用尚鲜有报道，且对多巴胺抗肿瘤活性的潜在机制知之甚少。本研究以人胶质瘤细胞株U251为研究对象，体外观察多巴胺对人胶质瘤细胞U251增殖、侵袭力的影响，并探讨其潜在的作用机制。

人胶质瘤细胞株U251（上海中国科学院细胞库），多巴胺（江苏亚邦强生药业有限公司）；胎牛血清、改良杜氏伊格尔培养基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）、青霉素、链霉素（美国Gibco公司）；细胞计数试剂盒（CCK-8）（北京英格恩生物科技有限公司）；AnnexinV、碘化丙啶（PI）、结晶紫染色液、甲醇（北京索莱宝科技有限公司）；Transwell小室、Matrigel基底胶（美国BD公司）；RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、细胞周期蛋白激酶4（cyclin dependent kinase4，CDK-4）、CDK-6、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase2，MMP-2）、MMP-9一抗、二抗（美国Abcam公司）；电化学发光（electrochemical luminescence，ECL）化学发光液（北京索莱宝科技有限公司）。SpectraMax iD5多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；Centrifuge 5418 R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；Chemi Scope 6000 Exp化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

将U251细胞放入37 ℃水浴锅中解冻后，无菌条件下，将细胞加入含有10 ％胎牛血清和1 ％青霉素 – 链霉素混合液的DMEM培养基，置于37 ℃，5 ％ CO ₂的恒温恒湿培养箱中培养，每24 h观察1次，待细胞80 ％以上融合后，弃去培养基，加入0.25％胰酶消化2～3 min，然后加入无血清DMEM培养基终止消化，进行传代培养。取对数生长期细胞，以1 × 10⁵个/mL接种于96孔板或35 mm小皿中，放于37 ℃，5 ％ CO₂的恒温恒湿培养箱中继续培养。

取对数生长期细胞，以1 × 10⁵个/mL接种于96孔板中，将细胞分为5组，分别加入多巴胺0（对照）、50、100、150、200 μmol/L，放于37 ℃，5 ％ CO₂的恒温恒湿培养箱中培养，于培养12、24、36、48 h时，每孔按照 CCK-8 : DMEM = 1 : 10 加入CCK-8试剂，继续培养2 h。放入酶标仪中，测定450 nm处吸光度（A）值，并绘制细胞生长曲线。每组细胞设置6个重复孔取平均值。

采用CCK-8法，取对数生长期细胞，以1 × 10⁵个/mL接种于96孔板中，并分为5组，分别加入多巴胺0（对照）、10、25、50、100 μmol/L继续培养48 h。按照试剂盒说明书检测各组U251细胞增殖情况。

采用流式细胞仪法，取对数生长期细胞，以1 × 10⁶个/mL接种于35 mm小皿，分为5组，分别加入多巴胺0（对照）、10、25、50、100 μmol/L继续培养48 h。收集细胞放入离心机中，1 200 r/min离心5 min，弃上清收集细胞，用事先预冷的磷酸缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline，PBS）冲洗细胞2次，加入染料AnnexinV和碘化丙啶（propidium iodide, PI）避光染色30 min。使用流式细胞仪分析G₀/G₁、S、G₂/M期细胞比例。每组细胞设置6个重复取平均值。

采用Transwell实验，使用无血清DMEM培养基稀释Mateigel基底胶（稀释比例1 : 10），取100 μL稀释后的Mateigel基底胶加入Transwell小室，铺满上室底部，在37 ℃条件下放置30 min。取培养48 h后的各组细胞，调整细胞浓度为5 × 10⁵个/mL，取100 μL细胞悬液接种于Transwell小室的上室，同时在下室中加入600 μL含有10 ％胎牛血清的DMEM培养基，放于37 ℃，5 ％CO₂的恒温恒湿培养箱中培养24 h。取出Transwell小室，弃去培养液，用PBS溶液冲洗2次，甲醇固定30 min后，加入0.1 ％结晶紫染色液染色20 min。用棉签轻轻擦掉上层未侵袭细胞，取下室膜平铺于载玻片上，× 100倍显微镜下随机观察5个视野，计数细胞数量。每组细胞设置6个重复取平均值。

采用蛋白质免疫印迹（Western blot）法，取培养48 h后的各组细胞，放入离心机中，1 200 r/min离心5 min，弃上清收集细胞，使用PBS冲洗后，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。以每孔50 μL加入十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳上样孔中进行电泳，分离目的蛋白，转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），用5 ％脱脂奶粉室温封闭1～2 h。分别加入cyclin D1、CDK-4、CDK-6、VEGF、MMP-2、MMP-9一抗，4 ℃下孵育过夜。磷酸盐吐温缓冲液（PBS Tween-20，PBST）洗膜3次，加入二抗，室温下孵育1 h，PBST溶液洗膜3次。加入ECL化学发光液，显影15 min，放入ChemiScope 6000 Exp化学发光成像系统中曝光，采集图像。使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以甘油醛 – 3 – 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，计算细胞中cyclin D1、CDK-4、CDK-6、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量。

计量资料用平均数 ± 标准差表示，应用SPSS 17.0软件进行统计分析，细胞百分比等两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD – t检验，以P < 0.05表示差异有统计学意义。

与对照组比较、多巴胺50、100、150和200 μmol/L组U251细胞增殖率明显下降（P < 0.05）；多巴胺作用36、48 h时，与50 μmol/L组比较，100、150和200 μmol/L组U251细胞增殖率明显降低（ P < 0.05）。因此，选择多巴胺处理浓度范围为0～100 μmol/L，处理时间48 h，进行后续试验。

结果显示，对照组、多巴胺10、25、50和100 μmol/L组U251细胞增殖率分别为（92.36 ± 1.37）％、（46.82 ± 1.17）％、（41.96 ± 1.06）％、（37.52 ± 0.98）％、（30.57 ± 1.11）％。与对照组比较，多巴胺10、25、50和100 μmol/L组U251细胞增值率明显下降（P < 0.05），且呈一定剂量依赖性（ P < 0.05）。

表 1

表 1 多巴胺对U251细胞周期影响（%， $\bar x \pm s$ ，n = 6） 组别（μmol/L） G0/G1期 S期 G2/M期 对照组 58.26 ± 1.32 31.04 ± 1.13 10.70 ± 2.01 多巴胺 10 61.93 ± 1.85 a 27.71 ± 1.69 a 10.36 ± 2.11 　　　 25 66.67 ± 2.06 ab 22.75 ± 2.16 ab 10.58 ± 2.32 　　　 50 72.14 ± 2.61 abc 18.37 ± 1.43 abc 9.48 ± 2.14 　　 100 79.93 ± 3.02 abcd 11.24 ± 3.15 abcd 8.83 ± 2.43 　　注：与对照组比较，a P < 0.05；与多巴胺10 μmol/L组比较，b P < 0.05；与多巴胺25 μmol/L组比较，c P < 0.05；与多巴胺50 μmol/L组比较，d P < 0.05。

表 1 多巴胺对U251细胞周期影响（%， $\bar x \pm s$ ，n = 6）

与对照组比较，多巴胺10、25、50和100 μmol/L组U251细胞G0/G1期比例明显增多，S期细胞比例明显减少（P < 0.05），且呈剂量效应关系（ P < 0.05）；各组G2/M期细胞比例差异无统计学意义（ P > 0.05）。

图 1

图 1 多巴胺对U251细胞侵袭能力影响（结晶紫染色，× 100倍）（彩图）

结果显示，对照组、多巴胺10、25、50和100 μmol/L组U251细胞侵袭数目分别为（1 099.82 ± 33.57）、（776.52 ± 25.16）、（555.43 ± 22.57）、（442.33 ± 12.03）、（336.82 ± 14.11）个。与对照组比较，各剂量多巴胺组U251细胞侵袭数目明显减少（P < 0.05），呈一定剂量效应关系（ P < 0.05）。

图 2

注：1 对照组；2～5 多巴胺10、25、50、100 μmol/L组。 图 2 多巴胺对U251细胞周期蛋白表达影响（Western blot）

表 2

表 2 多巴胺对U251细胞周期蛋白表达影响（%， $\bar x \pm s$ ，n = 6） 组别（μmol/L） Cyclin D1 CDK4 CDK6 对照组 1.14 ± 0.17 1.02 ± 0.20 0.86 ± 0.13 多巴胺 10 0.88 ± 0.21 a 0.77 ± 0.13 a 0.71 ± 0.09 a 　　　 25 0.63 ± 0.14 a 0.59 ± 0.10 a 0.55 ± 0.01 a 　　　 50 0.45 ± 0.11 a 0.41 ± 0.09 a 0.38 ± 0.09 a 　　 100 0.31 ± 0.08 a 0.30 ± 0.06 a 0.26 ± 0.07 a 　　注：与对照组比较，a P < 0.05。

表 2 多巴胺对U251细胞周期蛋白表达影响（%， $\bar x \pm s$ ，n = 6）

与对照组比较，各剂量多巴胺组U251细胞中cyclin D1、CDK4、CDK6蛋白相对表达量明显降低（P < 0.05）。

图 3

注：1 对照组；2～5 多巴胺10、25、50、100 μmol/L组。 图 3 多巴胺对U251细胞中VEGF等表达影响（Western blot）

表 3

表 3 多巴胺对U251细胞中VEGF等蛋白表达影响（%， $\bar x \pm s$ ，n = 6） 组别（μmol/L） VEGF MMP-2 MMP-9 对照组 0.86 ± 0.11 0.59 ± 0.09 0.92 ± 0.13 多巴胺 10 0.63 ± 0.08 a 0.40 ± 0.07 a 0.65 ± 0.10 a 　　　 25 0.47 ± 0.06 a 0.25 ± 0.05 a 0.42 ± 0.08 a 　　　 50 0.34 ± 0.04 a 0.14 ± 0.03 a 0.25 ± 0.05 a 　　 100 0.22 ± 0.05 a 0.07 ± 0.02 a 0.12 ± 0.03 a 　　注：与对照组比较，a P < 0.05。

表 3 多巴胺对U251细胞中VEGF等蛋白表达影响（%， $\bar x \pm s$ ，n = 6）

与对照组比较，各剂量多巴胺组U251细胞中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量均明显降低（P < 0.05）。

多巴胺主要在中枢神经系统和胃肠道中产生，研究表明，多巴胺通过激活内皮细胞和肿瘤细胞上的多巴胺受体来抑制肿瘤生长，在多种癌症中发挥抗癌作用^[6]。目前多项研究证实，神经内分泌癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌及黑色素瘤等多种肿瘤中均有多巴胺受体表达，且多巴胺受体激动剂、拮抗剂在泌乳素瘤、垂体腺瘤治疗中发挥重要作用^{[7 – 8]}。多巴胺可能是一种潜在的治疗胶质瘤的有效药物^[9]。本研究结果显示，多巴胺可抑制胶质瘤细胞U251增殖，抑制肿瘤细胞侵袭；多巴胺处理组U251细胞G0/G1期比例明显增加，S期比例明显减少。提示，多巴胺可以将胶质瘤细胞周期阻滞于G1期。Cyclin D和CDKs是调控细胞周期的核心分子，细胞癌变与细胞周期异常导致细胞过度增殖密切相关，90％以上肿瘤组织中存在Cyclin D和CDKs过度表达^{[10 – 11]}。本研究结果显示，多巴胺可抑制胶质瘤细胞U251中cyclin D1、CDK4、CDK6表达。CDK4、CDK6是细胞从G1期向S期转变过程中不可缺少的两种周期蛋白依赖性激酶，Cyclin D1是G1/S - 特异性周期蛋白，通过结合并激活CDK4/CDK6，推动细胞周期由G1期进入S期，从而促进细胞增殖^[12]。提示，多巴胺可能通过抑制cyclin D1表达，从而抑制CDK4、CDK6表达，阻断胶质瘤细胞周期向S期转变，起到抑制胶质瘤细胞增殖作用。

研究表明交感神经主要通过从神经末梢释放的神经递质和靶器官中存在的受体之间的相互作用影响新生血管形成，在血管生成中具有重要作用^{[13 – 14]}。血管生成包括血管内皮细胞、血管周细胞及血管内皮前体细胞成熟、增殖及迁移等过程，与肿瘤发生、发展及侵袭密切相关^[15]。外源性多巴胺可通过多巴胺受体2发挥抗血管生成作用和受体1激活周细胞环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）– 蛋白激酶A信号传导途径稳定肿瘤血管，阻断慢性应激介导的卵巢肿瘤生长和肿瘤内皮细胞周细胞覆盖增加^[16]。本研究结果显示，多巴胺处理可有效抑制胶质瘤细胞U251中VEGF、MMP-2、MMP-9表达。VEGF是体内诱导血管新生的重要因子，基质金属蛋白酶可降解多种细胞外基质，在破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障中起关键作用^{[17 – 18]}。临床研究证实VEGF、MMP-9、MMP-2在胶质瘤中高表达，促进肿瘤侵袭和转移，与胶质瘤恶性程度呈正相关^[19]。体外抑制VEGF表达可抑制胶质瘤细胞U251增殖和侵袭^[20]。提示，多巴胺抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭的作用可能与抑制VEGF/MMP-2/MMP-9信号通路有关。

综上所述，体外多巴胺处理可抑制人脑胶质瘤细胞U251中cyclin D1、CDK4、CDK6蛋白表达，将细胞周期阻滞于G1期，抑制胶质瘤细胞增殖；同时也可抑制VEGF、MMP-2、MMP-9表达，抑制细胞外基质降解，从而抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭。提示，多巴胺可能是脑胶质瘤临床治疗的潜在有效药物。