2. 航天中心医院
体内细胞在新陈代谢过程中可产生大量自由基和活性氧(reactive oxygen species,ROS),造成广泛的细胞损害[1]。自由基、过氧化物的产生与抗氧化和解毒之间的不平衡导致氧化应激,进而可能影响基因调控过程中细胞的分化[2],最终导致衰老、癌症、心血管疾病和糖尿病等疾病的发生、发展[3]。维生素C(vitamin C,VC)是一种水溶性天然抗氧化剂,能够清除机体代谢过程中产生的自由基和ROS,减少其对细胞分化、增殖的影响。补充VC在一定程度上能够逆转及缓解氧化应激和氧化损伤[4]。Richards等[5]对女性VD与寿命关系的研究认为,VD水平在一定程度上与寿命呈正相关关系。目前正在进行的一项调查研究发现,中国约85 %的健康人群VD缺乏,慢病人群VD缺乏 > 90 %,面临严重的发病风险。目前对健康女性人群体内VC、VD水平与抗氧化能力之间关系的定量研究和干预研究较少。本研究通过对太原市124名健康女性体内VC、VD 3水平与抗氧化能力关系的研究和对其中65名VD3不足和缺乏的健康女性补充VD3的干预研究,探讨VC和VD3水平对抗氧化能力的影响,为保障健康女性合理及时补充VC和VD3提供理论依据。
1 对象与方法 1.1 对象2017年3月4日及5日上午8 : 00~10 : 00收集2017年1 — 2月在山西省太原市山西民盛体检中心体检的124名25~45岁健康女性的血清样本。采取便利抽样的方法,选择符合纳入标准的健康女性。纳入标准:(1)体检指标正常;(2)25~45岁女性;(3)长期(> 10年)居住在山西省太原市内,自愿加入。调查对象平均年龄(40.50 ± 11.76)岁,参与调查人数共124人,有效率100 %。将124名研究对象分为高VC组(≥ 2 μg/mL)和低VC组(< 2 μg/mL)[6],分别为100人和24人。高VC组和低VC组在年龄、体质指数分布上组间差异均无统计学意义(P ≥ 0.05)。其中65人(均为高VC组)同意参与补充VD3的干预研究。该研究经山西医科大学伦理委员会批准,且均签订知情同意书。
1.2 方法 1.2.1 干预方法2017年3月6日 — 4月6日对25-(OH)D3水平 < 30 ng/mL [7]且同意参与干预研究的65人每人每天补充20 μg VD3(纽曼斯,美国泛美国际有限公司),干预30 d,比较干预前后25 – 羟基维生素D 3(25-hydroxyvitamin D3,25-(OH)D3)、1,25 – 二羟基维生素D 3(1,25-dihydroxy vitamin D3,1,25-(OH)2D3)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的变化。
1.2.2 检测方法清晨空腹采血10 mL,离心15 min,3 000 r/min分离血清。采用高效液相色谱 – 紫外检测法(high performance liquid chromatography ultraviolet detection method,HPLC-UV)检测血清VC水平,流动相为30 mmol/L磷酸二氢钾溶液 – 甲醇(体积比88 : 12),流速0.8 mL/min,进样量20 μL,手动进样,检测波长243 nm,pH 3.0,柱温35 ℃。参考刁娟娟等 [6]的方法对血清样品进行前处理,操作过程中注意避光、低温。将100 mg VC标准品溶于100 mL纯水中,梯度稀释,标准品浓度为0.312 5、0.625、1.25、2.5、5和10 μg/mL。采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测25-(OH)D3、1,25-(OH)2D3水平,采用比色法检测SOD和GSH-Px的活性,按照说明书进行操作。
1.2.3 仪器与试剂5415C型高速台式离心机(德国Eppendorf公司);高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司,Agilent-1200);酶标仪(美国Bio-Rad公司);721G可见分光光度计(上海精科仪电);VC标准品(美国Sigma公司);25-(OH)D3、1,25-(OH)2D3 ELISA试剂盒(上海BIO SWAMP公司);SOD、GSH-Px试剂盒(南京建成生物公司);磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠、磷酸、高氯酸、二硫苏糖醇和甲醇(国产色谱纯)。
1.3 统计分析采用SPSS 17.0软件进行分析,对高VC组和低VC组的指标符合正态分布的计量资料采用独立样本t检验,不符合正态分布的计量资料采用Mann-WhitneyU检验。采用Spearman秩相关分析VC、25-(OH)D3、1,25-(OH)2D3、SOD及GSH-Px之间的相关性。采用配对t检验分析VD3干预前后相关指标的变化。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 高VC组和低VC组血清各指标水平比较(表1)HPLC-UV检测结果显示,高VC组血清VC水平为(4.312 ± 1.683)μg/mL,低VC组为(1.568 ± 0.278)μg/mL。高VC组血清25-(OH)D3、1,25-(OH)2D3、SOD和GSH-Px水平高于低VC组,除25-(OH)D3外,高VC组与低VC组差异均有统计学意义(P < 0.05)。
2.2 各指标的相关性(表2)在一定范围内,VC与1,25-(OH)2D3、SOD和GSH-Px呈正相关关系,25-(OH)D3与1,25-(OH)2D3呈正相关关系,1,25-(OH)2D3与SOD呈正相关关系。
2.3 VD3补充前后血清各指标比较(表3)本研究124名健康女性中122人25-(OH)D3 < 30 ng/mL,占总人数的98.4 %,其中65人(均为高VC组)同意参与补充VD 3的干预研究。65人补充VD3后血清25-(OH)D3、1,25-(OH)2D3、SOD和GSH-Px水平高于补充前,且差异均有统计学意义(P < 0.05)。
3 讨 论抗氧化系统包括酶和非酶系统,谷胱甘肽(glutathione,GSH)属于抗氧化体系的非酶系统,能够清除自由基,是重要的细胞内低分子量的抗氧化剂。GSH-Px能够将还原型GSH转化成氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG),GSSG再由存在于肝脏和红细胞中的谷胱甘肽还原酶还原成GSH,使体内自由基的清除反应能够持续进行,发挥抗氧化作用[8]。SOD是一种能够消除机体新陈代谢过程中产生的有害物质的自由基清除剂,属于抗氧化物酶系统,广泛分布在生物体各类组织中。SOD与超氧自由基反应并将其转换为过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2),H2O2经过氧化氢酶的代谢和GSH-Px再还原成水和氧分子。近年来研究发现SOD在抗氧化、防治心脑血管疾病和自身免疫性疾病等方面具有重要作用[9]。此外,抗氧化防御的能力部分取决于体内适量的VC、维生素A(vitamin A,VA)、维生素E和抗氧化酶水平的增高[10]。
VC作为一种强抗氧化剂,能够延缓、减弱自由基与ROS对机体的损伤,能够维持巯基处于还原状态而保持酶的活性,可以使GSSG转化为GSH,还原机体代谢过程中产生的H2O2。本研究探讨VC和VD3对健康女性抗氧化能力影响的思路来源于VC可能参与VD3的活化。VD3首先在肝细胞线粒体内经25 – 羟化酶羟化形成其在人体血清中的主要储存形式25-(OH)D 3,但25-(OH)D3同VD3一样,不具有生物活性,必须再次在肾小管细胞内1 – α 羟化酶的作用下生成VD 3的活性形式1,25-(OH)2D3,1,25-(OH)2D3与细胞内VD受体(vitamin D receptor,VDR)结合发挥生物学效应。VC是VD3两次羟化过程中羟化酶的辅助因子,课题组前期关于VC、VD3与溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的研究发现葡聚糖硫酸钠诱导的UC豚鼠和UC患者体内VC水平与25-(OH)D3、1,25-(OH)2D3水平呈正相关关系[11 – 12]。研究证实VD不仅具有抗炎、神经保护、免疫调节的作用,并且具有抗氧化功能[13 – 14]。研究1,25-(OH)2D3 缺乏小鼠的皮肤实验中发现ROS类水平增加,皮肤组织中抗氧化酶表达减少,活性降低,脂质过氧化代谢产物丙二醛显著增多[15]。Hamden K等[16]对小鼠的研究认为1,25-(OH)2D3与内源性雌激素结构相似,与细胞核内的雌激素受体蛋白相结合,调节基因转录生成SOD,能够增强SOD的活性。VD3的活性形式可以上调生长停滞脱氧核糖核酸损伤诱导基因 – 45、p53等的表达,增强SOD1和SOD2的活性,以防止DNA的氧化损伤 [17]。在一项关于补充VA和VC对艾滋病毒和艾滋病氧化应激影响的研究中发现,与服用VA和VC的受试者相比,没有补充剂的人类免疫缺陷病毒单一感染受试者的氧化应激指标与基线相比显着降低[18]。本研究对65名健康女性进行的VD3干预试验发现,补充VD3后体内25-(OH)D3、1,25-(OH)2D3水平升高,在一定程度上能够提高机体的抗氧化能力。表明VC在一定范围内能够促进VD3活化为1,25-(OH)2D3,VC和VD3能够上调健康女性的抗氧化系统,降低机体的氧化应激水平,提高抗氧化能力。
本研究124名健康女性中122人25-(OH)D3 < 30 ng/mL,占总人数的98.4 %,提示绝大多数健康女性都表现出VD 3缺乏,但没有表现出明显的疾病症状,原因可能是虽然体内的VD3水平较低,但因其结合转运蛋白的能力各异,致使VD3的利用率不同[19]。1,25-(OH)2D3的减少还会导致一系列的连锁反应,如:辅助性T细胞1/辅助性T细胞2 比例失衡导致免疫功能下降,T淋巴细胞增殖导致UC发生[20],Ⅰ型糖尿病风险增加[21]等。提示健康女性应依据《中国居民膳食营养素参考摄入量》的推荐摄入量[22]及时进行补充,预防相关疾病的发生、发展。
以往研究主要集中在特定疾病人群,并且更多地集中探讨一些抗氧化酶与衰老、抗氧化的关系,本研究着重探讨血清VC和VD3水平与健康女性抗氧化能力的关系。研究的局限性在于采样主要集中在一个地区,样本量较少,代表性不足,后续可通过与社区建立长期合作关系的方式扩大样本量,分季节进行横断面研究,全面反应体内VC、VD3水平与健康女性抗氧化能力的关系。在经过医学伦理委员会审查后,可以对健康女性进行不同剂量VC和VD3的干预研究,探讨剂量反应关系及VC联合VD3对健康女性抗氧化能力的提高是否具有协同作用,寻找VC和VD3的最佳干预剂量。VC是羟化酶的辅助因子,但是VC参与VD3羟化的具体机制尚不清楚,可以通过检测血清中羟化酶的活性、VDR的表达及钠依赖性VC转运蛋白1和钠依赖性VC转运蛋白2等指标,再结合国内外的研究结果及先进的实验方法,深入探讨VC参与VD3羟化的具体机制。另外,VC与VD3的摄入与调查对象的饮食、运动等生活习惯息息相关,可以通过对调查对象进行相关问卷调查,分析其与体内VC、VD3水平的关系,寻找VC、VD3缺乏的原因,达到提高VC、VD3水平和抗氧化能力的目的。如果在人群试验中得到与本研究相一致的结论,则可以考虑通过动物实验和细胞实验进行验证,反向证明VC参与VD3的活化,VC联合VD3能够改善抗氧化能力。因为豚鼠与人体一样,自身缺乏合成古洛糖酸内酯氧化酶的基因[23],所以动物实验可以采用豚鼠作为实验动物,在VD3干预剂量一致的情况下,分为高剂量VC干预组和低剂量VC干预组,检测血清25-(OH)D3、1,25-(OH)2D3水平和相关氧化指标的变化,验证VC是否参与VD3的活化及其联合应用是否可以提高抗氧化能力。其次,可以对豚鼠进行不同VC、VD3剂量的交叉干预,相比人群干预更易实现,干预结束后检测相关氧化指标,探讨VC、VD3对抗氧化能力的影响。同理可进行相关的体外实验,验证结论,为临床营养干预提供理论依据。
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