2. 广东盈亨生物科技有限公司;
3. 西悉尼大学澳大利亚国家补充医学研究院
家蝇(Musca domestic)为双翅目蝇科完全变态昆虫,广泛分布于世界各地。由于生长环境以及生活习性等原因,家蝇一直被认为是传播霍乱与伤寒等疾病的重要媒介。然而,相关研究发现,尽管家蝇传播各种疾病但他们只是病原菌的携带者,而非中间寄主[1],相反,其体内的许多免疫活性物质对病原菌具有杀灭作用。近年来,发现家蝇体内存在很多具有生物学价值的物质,可以作为药用蛋白质、油脂的重要来源。其中家蝇体内的抗菌活性物质包括抗菌肽、凝集素、溶菌酶,幼虫排放到体外有生物活性的分泌物,表皮中的几丁质,以及存在于其他组织器官或代谢产生的粪产碱菌、有机化合物和尿囊素等[2]。
溶菌酶(lysozyme),是一种糖苷水解酶,能特异性溶解细菌的细胞壁[3],1976年,首次于昆虫淋巴液中纯化得到[4]。溶菌酶是生物组织中广泛存在的一种无毒的低分子碱性蛋白酶,在哺乳动物、爬行动物、鸟类、海洋生物(如虾类、鱼类)、昆虫体内均有发现,同时也是这些生物体内天然免疫系统的重要组成部分[5 – 8]。作为一种天然抑菌和抗菌剂,溶菌酶主要催化细菌骨架物质-肽聚糖的降解,导致细菌裂解死亡,是家蝇免疫防御系统中的重要成员[9]。近年,关于家蝇溶菌酶的研究多集中在家蝇体内溶菌酶的分离纯化、抗菌活性、组织中的表达定位以及相关溶菌酶基因等[10 – 11],而有关其体外分泌物的研究较少。本研究通过观察家蝇幼虫体外分泌物中溶菌酶含量,并进一步对家蝇幼虫体外分泌物的抗菌抗炎活性进行评估,旨在为家蝇体外分泌物的深入研究提供依据。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂Bio-Rad电泳装置(美国Bio-Rad公司),智能霉菌培养箱(上海晟析实验仪器有限公司),Biotek酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。溶菌酶标准品、溶壁微小球菌粉末(南京建成生物工程研究所),磷酸氢二钾和磷酸二氢钾(广州化学试剂厂),丙烯酰胺(天津市大茂化学试剂厂),十二烷基磺酸钠(天津市致远化学试剂有限公司),大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌菌株(ATCC25923)(中山大学药理实验室),牛肉浸膏(广东环凯微生物科技有限公司),蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司);RAW 264.7细胞(中山大学药理学实验室),DMEM培养基(Dulbecco's modified Eagle medium)[赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司],胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)。
1.2 家蝇家蝇3日龄幼虫,由广东盈亨生物科技有限公司提供,经中山大学药学院杨得坡教授鉴定为双翅目蝇科家蝇的幼虫。
1.3 家蝇幼虫体外分泌物溶菌酶检测 1.3.1 家蝇幼虫体外分泌物提取与纯化于家蝇幼虫2日龄阶段,向培养基中按照5 mL/kg加入大肠杆菌和金黄色葡萄球菌液进行共培养。2天后收集家蝇3日龄幼虫约100 g,洗净,风干后放入开口性容器中,断水断食自由活动6 h,采用无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)溶解附着于容器和虫体表面的家蝇幼虫体外分泌物,离心(4 ℃,13 000 r/min,30 min)取上清液后分别用3、10 kDa超滤管(4 ℃,13 000 r/min,10 min)纯化,得到分子量在10~30 kDa之间的家蝇幼虫体外分泌物溶液,冷冻干燥后得到320 mg体外分泌物。
1.3.2 十二烷基磺酸钠 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl-polyacryl gradient gel electrophoresis, SDS-PAGE)将分泌物样品配成溶液,按照50 μg/孔上样,同时以溶菌酶标准品作为对照,进行SDS-PAGE电泳;5 % 浓缩胶,15 % 分离胶,电泳完成后采用考马斯亮蓝染色法进行染色观察。
1.3.3 家蝇幼虫体外分泌物中溶菌酶含量测定配制系列浓度溶菌酶标准品溶液0、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL;配制溶壁微小球菌悬浮液,浓度为250 μg/mL;取溶菌酶标准液20 μL与200 μL溶壁微小球菌菌液混匀,37 ℃孵育5 min后测定吸光度,作出标准曲线;将分泌物冻干粉配制成浓度为20 mg/mL的待测样品溶液。取20 μL待测样品溶液与200 μL溶壁微小球菌液混合,37 ℃孵育5 min后在600 nm测定吸光度(A)值,得到吸光度值后代入标准曲线计算样品的溶菌酶浓度。
1.4 家蝇幼虫体外分泌物抗菌活性检测 1.4.1 生长曲线测定取出冻存于甘油中的菌种(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)20 μL加入到100 mL三角瓶中,37 ℃恒温摇床上以160 r/min速度震荡培养,约24 h后,停止培养,此时的菌悬液作为活化好的菌种液。将活化好的菌种取3 mL加入到97 mL肉汤培养基中,放入恒温摇床中培养,依次在0、2、3、4、5、7、11、15、19、25 h时取出200 μL菌液测定600 nm处吸光度(A)值并记录,以时间为横轴,吸光度(A)值为纵轴做出平滑曲线即为细菌生长曲线。
1.4.2 抑菌曲线测定抑菌曲线测定基本操作同生长曲线,只需要在加入菌悬液的同时加入分泌物,使得分泌物浓度为20 mg/mL。
1.5 家蝇幼虫体外分泌物抗炎活性检测 1.5.1 噻唑蓝(methylthiazolyl tetrazolium, MTT)实验按照5 000个细胞/孔种板,放入培养箱中培养24 h后加入分泌物,终浓度为100 μg/mL,培养24 h,避光加入浓度为5 mg/mL的MTT试剂,20 μL/孔,继续培养4 h,然后用注射器吸干各孔中的液体后按照100 μL/孔加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶剂,将96孔板放于摇床上5 min使沉积于底部的紫色晶体完全溶解,最后用酶标仪测定540 nm处的吸光度(A)值。
1.5.2 细胞培养液中一氧化氮(NO)含量测定RAW264.7细胞培养于含10 % 胎牛血清的DMEM培养液(含100 mg/mL青霉素,100 mg/mL链霉素)中,置于37 ℃、5 % CO2、95 % 饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期的RAW264.7细胞按照5.5万个/孔种板,放入培养箱中培养24 h后进行实验,实验设对照组、脂多糖组和分泌物组,加入DMEM培养液100 μL,分泌物组加入脂多糖(1 μg/mL)以及家蝇幼虫体外分泌物(100 μg/mL);脂多糖组加入脂多糖(1 μg/mL);对照组加入等体积的PBS溶液替代实验组中的家蝇分泌物溶液。继续培养24 h,按照一氧化氮试剂盒说明书检测细胞培养上清液中的NO含量。每个实验组设置3个复孔,并重复3次实验.
2 结 果 2.1 家蝇体外分泌物中溶菌酶定性定量检测(图1)结果显示,家蝇体外分泌物样品在与溶菌酶标准品同等位置出现了一个条带;比浊法结果显示,家蝇体外分泌物中的溶菌酶含量为(0.432 ± 0.01)μg/mg。
2.2 家蝇体外分泌物抗菌活性(图2)结果显示,家蝇体外分泌物经过超滤管纯化之后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌存在抑菌作用。
2.3 家蝇体外分泌物抗炎活性MTT结果显示,家蝇幼虫体外分泌物中10~30 kDa段成分在100 μg/mL浓度下RAW264.7细胞存活率为(101 ± 4.3)%;细胞存活率 > 95 %,表明对RAW264.7细胞无明显毒性。对照组、脂多糖组、分泌物组RAW264.7细胞培养液中NO(nitric oxide)含量分别为(0.42 ± 0.02)、(15.34 ± 2.05)、(7.32 ± 0.62)μmol/L;与对照组比较,脂多糖组RAW264.7细胞培养液中NO含量明显升高;与脂多糖组比较,RAW264.7细胞培养液中NO含量明显下降。提示,家蝇幼虫体外分泌物中10~30 kDa段成分在100 μg/mL浓度下对由脂多糖诱导引起的炎症因子NO含量升高具有抑制作用,家蝇分泌物存在一定的抗炎作用。
3 讨 论研究显示,家蝇体内存在多种免疫物质可以抵抗病原菌的侵蚀[12],而家蝇构造简单,肠道极短,因此推测,家蝇能够分泌某些抑制细菌生长的活性物质。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性细菌的细胞壁组分,是诱导内皮细胞炎症反应和功能紊乱的重要因素之一。LPS诱导内皮细胞表达包括一氧化氮(NO),前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2),肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha, TNF-α),白介素1 β( interleukin-1 β, IL-1 β)等炎症因子[13]。其中NO的过量生成与炎症反应关系密切[14]。本研究采用脂多糖诱导RAW 264.7细胞形成炎症模型,通过观察细胞培养上清液中的NO含量来评价家蝇幼虫体外分泌物对炎症的抑制作用。
本研究结果显示,在家蝇幼虫体外分泌物中10~30 kDa组分中具有溶菌酶存在。目前,关于家蝇抗菌抗炎物质的研究多集中在体内,虫体内基础成分复杂多样,纯化困难。若体外分泌物也同样存在类似效果,而相较而言,体外分泌物成分简单,容易进行分离纯化。前期实验采用未经纯化的家蝇幼虫体外分泌物进行活性实验,未发现其分泌物具有抗菌抗炎活性。本研究采用超滤管纯化后得到的含有溶菌酶的10~30 kDa组分进行活性研究,发现该组分具有一定的抗菌抗炎作用。提示,杂蛋白的存在会一定程度上阻碍溶菌酶发挥活性,因而需要对分泌物进行进一步纯化。研究表明溶菌酶作为一种碱性蛋白,不同的环境条件(如温度、pH、储存时间)均会对其活性产生影响[15],家蝇溶菌酶含量和活性同样受储存温度和时间影响,低温利于溶菌酶储存,存储时间越长家蝇体外分泌物中溶菌酶含量越低、相应的活性也越低[16]。本研究中利用活的家蝇幼虫获取体外分泌物,得到的分泌物经过纯化后冷冻干燥保存,可最大程度上保证其活性。
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