高脂血症（hyperlipemia，HLP）是一种常见的以血浆中脂质量和质出现异常为主要表现的代谢性疾病，随着经济发展和物质生活逐渐丰富，高脂血症趋于年轻化、普遍化，其发病隐匿、渐进发展、渐及全身，尤其与心脑血管疾病的发生高度相关，威胁着人类身体健康^{[1 – 3]}。临床研究认为脾失健运，湿聚痰生，壅滞血脉为其主要发病机制^[4]。泽泻汤加味方具有祛湿消痰、健运脾胃之功，临床运用疗效显著，但其作用机制尚不明确。水通道蛋白（aquaporin，AQPs）是在机体水液代谢中起着重要作用的跨膜转运蛋白，AQPs的表达异常则导致体内的水湿停聚^[5]。本研究拟观察泽泻汤加味方对高脂血症大鼠血脂及AQP3和AQP4基因、蛋白表达的影响，旨在探讨泽泻汤加味方改善高脂血症的作用靶点和机制。结果报告如下。

泽泻汤加味方（泽泻50 g、白术20 g、荷叶10 g）（广东一方制药有限公司生产的中药配方颗粒，产品批号：5073461、5063421、505037T），用100 ℃蒸馏水充分溶解，冷却后置4 ℃冰箱贮存备用；辛伐他汀片[石药集团中诺药业（石家庄）有限公司]，加入到0.5 %羧甲基纤维素钠混悬液中，4 ℃冰箱冷藏备用；胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglyceride, TG）（中国中生北控生物科技股份有限公司）；高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）（长春汇力生物技术有限公司）；总RNA提取试剂、cDNA合成试剂盒、PCR反应体系、DNA标准（日本Takara公司）；一抗AQP3和AQP4兔抗IgG多克隆抗体（美国bioworld公司）。PE9600型PCR扩增仪（美国PE公司）、电泳仪及电泳槽（北京六一生物科技有限公司）；紫外透射仪（北京鼎国生物有限责任公司）；UVP凝胶成像系统（美国thermo公司）、半干转膜仪系统（日本ATTO公司）、紫外可见分光光度计（美国Milton Roy公司）、转移脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造有限公司）。

雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠60只，specific pathogen free（SPF）级，体重（180 ± 20）g，由河北省实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（冀）2013 – 1 – 003。普通饲料由河北省实验动物中心提供，高脂饲料 ^[6]由普通饲料、猪油、胆固醇、猪胆酸钠等组成，按88 : 10 : 1.5 : 0.5比例均匀混合，由河北省实验动物中心加工制备，并进行Co⁶⁰照射。

大鼠适应性喂养1周，按体重随机分为6组，每组10只，对照组、模型组、阳性对照组（辛伐他汀）以及泽泻汤加味方高、中、低剂量组（29.56、14.78、7.39 g/kg）。对照组大鼠喂饲普通饲料，其余各组喂饲高脂饲料造模，同时阳性对照组大鼠灌服辛伐他汀（1.89 mg/kg），各剂量泽泻汤加味方组大鼠给予不同剂量的泽泻汤加味方水溶液，对照组与模型组大鼠灌服蒸馏水。每日灌胃1次，灌胃体积均按 1 mL/100 g计算，连续5周，大鼠自由饮水进食。第5周末，大鼠禁食不禁水24 h，麻醉后股动脉取血，将血样离心，分离血清待检。迅速打开腹腔，剖取肝脏和结肠，先取适当大小的结肠组织，剪开冲洗干净后，液氮保存，用于检测AQP3和AQP4 mRNA及蛋白表达，再取大小约为1.0 cm × 1.0 cm × 0.3 cm的肝组织放于4 %多聚甲醛液中固定，以备病理形态学观察。

股动脉取血，室温静置30 min后，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，采集血清置于EP管中，用全自动生化分析仪检测血清TG、TC、HDL-C、LDL-C含量。

取4 %多聚甲醛溶液中固定的肝组织，常规脱水，石蜡包埋，切片，苏木精 – 伊红（HE）染色，200倍光镜下观察肝组织的形态学变化。

采用real-time reverse transcription PCR （RT-PCR）法，取 – 70℃冻存的结肠组织100 mg，加入到1 mL Trizol中，于冰上匀浆，提取总RNA，紫外分光光度计测量其浓度和纯度，电泳检测其完整性。调整RNA浓度为 1 μg/μL，将其反转录成cDNA。AQP3上游引物: 5′-CACCCCATAAAAGCCCCCTT-3′；下游引物: 5′-AAACTTGGTCCCTTGCCCTT-3′，扩增产物片段长度为304 bp。AQP4上游引物5′-CAGAACCAAGGCGTAAACCG-3′；下游引物5′-TCGACCCTAACCAAGTCTCC-3′，524 bp。β-actin引物序列为：上游：5′-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3′，下游：5′-AGGGTACATGGTGGTGGCGCCAGAC-3′，587 bp。反应体系为：50 μL反应体系含Taq DNA聚合酶、dNTPs、上样染料、稳定剂、优化剂、反应缓冲液、逆转录反应产物、上下游引物。PCR扩增反应条件为：变性94 ℃、30 s，退火56 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，30个循环，最后延伸10 min。半定量分析：取每个标本的扩增产物6 μL于1 %含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker（DL2000）作为标准分子量标记，电泳后摄片，并进行光密度扫描，以 β-actin校正作相对量分析。

采用Western blot法，取大鼠结肠组织约100 mg，液氮研磨，然后转移到900 μL的含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA中性裂解液当中，混匀，超声裂解，配平后4 ℃，12 000 r/min离心 15 min，收集上清，进行蛋白含量测定。蛋白煮沸变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5 %脱脂奶粉封闭，一抗4 ℃孵育过夜，PBST（phosphate buffer solution with Tween-20）洗膜3次，二抗室温孵育1.5 h，PBST洗膜3次，暗室曝光，X胶片上显影，用Tanon Gis软件扫描各条带吸光度（A）值并分析结果。

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据用 $\overline x $ ± s表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较用最小显著差法检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

表 1

表 1 泽泻汤加味方对大鼠血脂水平影响（mmol/L， $\bar x \pm s$ ，n = 10） 组别（g/kg） TG TC LDL-C HDL-C 对照组 0.860 ± 0.091 0.994 ± 0.132 0.641 ± 0.083 1.032 ± 0.117 模型组 2.183 ± 0.204 a 2.013 ± 0.250a 1.267 ± 0.087a 0.731 ± 0.085a 阳性对照组 1.89 mg/kg 1.153 ± 0.144 b 1.154 ± 0.145b 0.775 ± 0.083b 0.955 ± 0.100b 泽泻汤加味方 7.39 1.505 ± 0.145 b 1.566 ± 0.140 b 0.964 ± 0.088b 0.749 ± 0.071c 　　　　　 14.78 1.428 ± 0.131b 1.358 ± 0.169 bd 0.900 ± 0.099 b 0.757 ± 0.072c 　　　　　 29.56 1.205 ± 0.139 beg 1.164 ± 0.197 bef 0.787 ± 0.057 beg 0.904 ± 0.115 bdf 　　注：与对照组比较，a P < 0.05；与模型组比较：b P < 0.01，c P < 0.05；与低剂量组比较，d P < 0.05，e P < 0.01；与中剂量组比较，f P < 0.05，g P < 0.01。

表 1 泽泻汤加味方对大鼠血脂水平影响（mmol/L， $\bar x \pm s$ ，n = 10）

与对照组比较，模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均升高（P < 0.01），HDL-C含量降低（ P < 0.01）；与模型组比较，阳性对照组、各剂量泽泻汤加味方组大鼠血清中TG、TC、LDL-C含量均降低，HDL-C含量均升高（ P < 0.01或 P < 0.05）。

对照组大鼠肝细胞为规则6边形，排列整齐，围绕中央静脉呈放射状分布，肝血窦结构正常，无脂肪滴和炎性浸润。模型组大鼠肝细胞排列不整齐，且出现大量脂肪滴，细胞核位置被挤压偏离，肝血窦充血水肿。阳性对照组大鼠肝细胞结构清晰，脂肪滴明显减少，肝血窦充血水肿减轻，但存在细胞坏死及炎性浸润。泽泻汤加味方高、中、低剂量组大鼠较模型组肝组织结构排列清晰，脂肪滴不同程度减少，肝血窦形态趋于正常，尤以高剂量组效果显著。

图 1

注：1：对照组 2：模型组 3：阳性对照组；4～6：泽泻汤加味方低、中、高剂量组。 图 1 泽泻汤加味方对高脂血症大鼠结肠组织中AQP3、AQP4 mRNA表达影响

表 2

表 2 泽泻汤加味方对高脂血症大鼠结肠组织中AQP3、AQP4 mRNA表达影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 6） 组别（g/kg） AQP3 AQP4 对照组 0.241 ± 0.015 0.305 ± 0.023 模型组 0.485 ± 0.025 a 0.488 ± 0.027 a 阳性对照组 1.89 mg/kg 0.453 ± 0.018b 0.450 ± 0.019b 泽泻汤加味方 7.39 0.442 ± 0.013b 0.441 ± 0.013b 　　　　　 14.78 0.387 ± 0.009bd 0.411 ± 0.022bc 　　　　　 29.56 0.307 ± 0.011bde 0.323 ± 0.012bde 　　注：与对照组比较，a P < 0.01；与模型组比较，b P < 0.01；与低剂量组比较，c P < 0.05，d P < 0.01；与中剂量组比较，e P < 0.01。

表 2 泽泻汤加味方对高脂血症大鼠结肠组织中AQP3、AQP4 mRNA表达影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 6）

结果显示，与对照组比较，模型组大鼠结肠中AQP3和AQP4 mRNA表达均升高（P < 0.01）；与模型组比较，中、高剂量泽泻汤加味方组大鼠结肠组织中AQP3和AQP4 mRNA表达均降低（ P < 0.01）。

图 2

注：1：对照组 2：模型组 3：阳性对照组；4～6：泽泻汤加味方低、中、高剂量组。 图 2 泽泻汤加味方对高脂血症大鼠结肠组织中AQP3、AQP4蛋白表达影响

表 3

表 3 泽泻汤加味方对高脂血症大鼠结肠组织中AQP3、AQP4蛋白表达影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 6） 组别（g/kg） AQP3 AQP4 对照组 0.326 ± 0.042 0.279 ± 0.045 模型组 0.944 ± 0.052a 0.701 ± 0.067a 阳性对照组 1.89 mg/kg 0.798 ± 0.076b 0.619 ± 0.065a 泽泻汤加味方 7.39 0.782 ± 0.054b 0.523 ± 0.015b 　　　　　 14.78 0.627 ± 0.100bd 0.444 ± 0.033bc 　　　　　 29.56 0.502 ± 0.085bdf 0.366 ± 0.061bde 　　注：与对照组比较，a P < 0.01；与模型组比较：b P < 0.01；与低剂量组比较，c P < 0.05，d P < 0.01；与中剂量组比较：e P < 0.05，f P < 0.01。

表 3 泽泻汤加味方对高脂血症大鼠结肠组织中AQP3、AQP4蛋白表达影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 6）

与对照组比较，模型组大鼠结肠组织中AQP3和AQP4蛋白表达升高（P < 0.01）；与模型组比较，各剂量泽泻汤加味方组大鼠结肠组织中AQP3、AQP4蛋白表达均降低（ P < 0.05）；呈剂量效应关系。

中医据高脂血症临床表现及舌脉等特点，将其归于“痰浊”、“血瘀”等范畴^[7]，临床分为不同证型予以辩治^[8]。中医认为高脂血症多是由于饮食饥饱失节、偏嗜醇甘厚味、久坐怠惰懒动、情志抑郁失畅等致使脾运功能下降，水湿停聚成痰，痰浊停积生成“脂膏”，注入血液、壅塞血脉而诱发。脾失健运、痰浊内生为其基本病机，健脾祛湿消痰为其有效治法。泽泻汤加味方是在《金匮要略》泽泻汤的基础上加入荷叶而成，方中泽泻利水道、祛水湿、消痰浊、降血脂，白术补气健脾、燥湿利水，既健脾益气以助运化，又祛已成之痰湿，更加以荷叶升清降浊，祛湿利尿，三药同用，驱邪扶正，标本兼顾，共奏消痰祛浊，健运脾胃之功。

水通道蛋白（AQPs）到目前为止共发现13个亚型，AQP0～12，存在于人体多个组织器官并参与机体水液代谢，其中AQP3、AQP4在结肠组织表达较多^{[9 – 10]}。结肠是肠道水分重吸收的重要场所，结肠上皮细胞排列致密，对细胞旁路这一吸收途径有所限制，因此跨细胞膜转运成为结肠对水分吸收的主要途径。而水通道蛋白则是介导细胞膜的跨膜水转运的一类蛋白，能快速转运人体的水分子及小分子通过细胞膜。有关通过调控结肠中AQPs表达、调节水液代谢防治消化系统疾病的研究较多，李姿慧等^[11]研究发现溃疡性结肠炎大鼠结肠中AQP3、AQP4表达减少，经具有健脾祛湿作用的参苓白术散治疗以后，随着AQP3、AQP4表达上调，腹泻症状随之好转。薛晓倩等^[12]研究显示，藿香正气液能够上调脾虚湿阻的腹泻模型大鼠结肠中AQP4表达，可能是其治疗泄泻的重要机制。

TC是血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和，HDL-C能将动脉壁上以及外周组织的TC逆向转运至肝脏中代谢排出，LDL-C由肝脏合成并分泌到血液，转运肝脏TC至血液及全身组织^[13]，高脂血症常表现为血液中TC、TG、LDL-C浓度升高及HDL-C浓度降低^[14]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠TG、TC、LDL-C明显升高，HDL-C明显降低。提示，高脂血症造模成功。在血脂异常同时，结肠组织中AQP3、AQP4基因、蛋白表达增强，表明血脂异常与结肠组织AQP3、AQP4表达相关，AQP3、AQP4表达上调抑制水分从肠壁到肠腔转运，致使水湿停聚，酿生痰浊，导致高脂血症。本研究结果表明泽泻汤加味方组大鼠血脂水平明显降低，肝脏脂肪变性减轻，结肠组织中AQP3、AQP4基因、蛋白表达明显减弱。提示，泽泻汤加味方通过调控AQP3、AQP4表达，使结肠组织因其重吸收过度导致的水液停聚得到改善，阻止痰湿的生成，进而达到改善高脂血症的目的。