中国公共卫生  2019, Vol. 35 Issue (3): 309-312   PDF    
玛咖水提物在PC12细胞对抗化学性缺氧损伤中作用
张静1, 陈萌1, 赵君2, 周雯1, 李慧1, 唐慧1, 张天亮1, 范轶欧1    
1. 山东省疾病预防控制中心,济南 250014;
2. 滨州市滨城区市立医院
摘要目的 探讨玛咖水提物在PC12细胞对抗二氯化钴(CoCl2)诱导化学性缺氧损伤中的作用及机制。方法 应用不同浓度的CoCl2处理PC12细胞不同时间,建立化学性缺氧损伤模型。应用细胞增殖检验试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率;试剂盒法测定细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮合酶(NOS)的活性,检测丙二醛、一氧化氮(NO)及乳酸脱氢酶(LDH)的含量;NO荧光探针(DAF-FM DA)染色流式细胞术检测细胞内NO含量;Annexin V-FITC/PI 染色检测细胞凋亡率。结果 与对照组比较,CoCl2组PC12细胞存活率明显受到抑制,且呈现一定的浓度与时间依赖性;与对照组比较,300 μmol/L CoCl2组PC12细胞存活率[(51.55 ± 2.71)%]明显降低,细胞培养液中SOD、NOS活性升高,丙二醛、NO和LDH含量增加;与CoCl2组比较,60、120 μg/mL玛咖组PC12细胞存活率[分别为(63.99 ± 3.24)%、(69.95 ± 2.25)%]明显升高,细胞培养液中NOS活性降低,丙二醛、NO和LDH含量降低。与对照组比较,500 μmol/L CoCl2组PC12细胞内NO含量[(61.5 ± 5.7) %]明显升高,细胞凋亡率[(41.33 ± 3.83)%]明显增加;与500 μmol/L CoCl2组比较,60、120 μg/mL玛咖组细胞内NO含量[分别为(36.5 ± 4.7)%、(33.4 ± 3.8)%]明显降低,细胞凋亡率[分别为(34.87 ± 2.50)%、(31.33 ± 3.44)%]明显下降。结论 玛咖水提物对CoCl2诱导的化学性缺氧损伤具有一定拮抗作用,其机制可能与抑制NO的产生、减轻氧化应激反应,抑制细胞凋亡有关。
关键词玛咖(maca)     二氯化钴(CoCl2     一氧化氮(NO)     凋亡    
Effect of maca water extract on cobalt chloride-induced hypoxia injury in PC12 cells
ZHANG Jing, CHEN Meng, ZHAO Jun, et al     
Shandong Provincial Center for Disease Control and Prevention, Ji'nan, Shandong Province 250014, China
Abstract: Objective To explore the effect of maca water extract on cobalt chloride (CoCl2)-induced hypoxia injury in PC12 cells. Methods PC12 cells were exposed to CoCl2 at different dose and for different time duration to set up the chemical hypoxia injury model. Cell viability was determined with cell counter kit-8 (CCK-8). The activity of superoxide dismutase (SOD) and nitric oxide synthase (NOS), the quantity of malondialdehyde (MDA), nitric oxide (NO), and lactate dehydrogenase (LDH) in culture medium were measured with kit assay. The intracellular NO was detected using a fluorescent probe (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA). The cell apoptotic rate was determined with annexin V-FITC/PI staining. Results Compared with that of the control cells, the viability of PC12 cells exposed to CoCl2 was inhibited significantly in a dose- and time-dependent manner. Significantly decreased cell viability rate (51.55% ± 2.71%) and increased of SOD and NOS and content of MDA, NO, and LDH in culture medium were observed in PC12 cells exposed to 300 μmol/L CoCl2 for 24 hours in comparison with those of the control cells. For the PC12 cells treated with maca water extraction of 60 and 120 μg/ml, the viability rate increased obviously (63.99% ± 3.24% and 69.95% ± 2.25%) and the NOS activity and content of MDA, NO, and LDH in culture medium decreased compared to the CoCl2 exposed PC12 cells. Obviously increased intracellular NO content (61.5% ± 5.7%) and cell apoptotic rate (41.33% ± 3.83%) were observed in the PC12 cells treated with 500 μmol/L CoCl2 for 24 hours compared to the control cells. Obviously decreased intracellular NO content (36.50% ± 4.70% and 33.40% ± 3.80%) and cell apoptotic rate (34.87 ± 2.50% and 31.33% ± 3.44%) were observed in the PC12 cells treated with maca water extraction of 60 and 120 μg/ml compared to those in the cells exposed to 500 μmol/L CoCl2. Conclusion Maca water extract has protective effect on cobalt chloride-induced hypoxia injury by inhibiting NO generation, oxidative stress and cell apoptosis in PC12 cells.
Key words: maca     cobalt chloride     nitric oxide     apoptosis    

玛咖(maca)为十字花科独行菜属植物(Lepidium meyenii Walp)的根茎,是印加人重要的食物来源之一。2003年在我国云南丽江引种成功[1]。研究证实,玛咖可增强免疫力、提高生育力、改善性功能、治疗女性更年期综合征等[23],玛咖具有抗疲劳及抗氧化作用[4];玛咖具有清除自由基,提高细胞抗氧化能力功效[5]。本研究采用二氯化钴(cobalt chloride,CoCl2),一种常用的化学性低氧模拟剂损伤具有神经元形态和功能特征、来源于大鼠嗜铬细胞瘤的PC12细胞,建立化学性缺氧损伤模型,探讨玛咖拮抗CoCl2引起的PC12细胞缺氧损伤作用及机制。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

采集云南产玛咖鲜根,低温干燥后粉碎,过60目筛获得玛咖粉;玛咖提取物采用玛咖粉为原料,用水提取,浓缩并烘成干浸膏,低温避光密封保存,1 g玛咖提取物约相当于3 g生药。CoCl2(美国Sigma公司),DAF-FM DA(上海碧云天生物技术有限公司),annexin V-FITC/PI(美国eBioscience公司),cell counting kit-8(CCK-8)细胞增殖检测试剂盒(日本Dojindo公司),DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)培养基、胎牛血清、谷氨酰胺、胰酶(美国Gibico公司),Hanks液、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。FACS流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司);SPECTRAMAX plus酶标仪(美国Molecular Devices公司);CO2培养箱(德国Thermo公司)。

1.2 细胞培养与分组

大鼠肾上腺嗜铬瘤(PC12)细胞(中科院上海细胞库)接种于体积分数为10 %胎牛血清的DMEM培养基,于37 ℃、5 % CO2的细胞培养箱中培养,选取对数生长期细胞进行实验。将PC12细胞分为0(对照组)、200、300、400、500、600、800、1 000、2 000 μmol/L共9组,采用CoCl2处理24 h,观察量 – 效关系;采用300 μmol/L CoCl 2处理PC12 细胞0(对照组)、12、24、36、48、60 h,观察时 – 效关系;将PC12细胞分为对照组、CoCl 2组[应用300 μmol/L CoCl2处理细胞24 h(在细胞内NO测定及细胞凋亡率实验中,应用500 μmol/L CoCl2处理细胞24 h)]、maca低、中、高剂量组(CoCl2处理细胞前3 h,分别加入30、60、120 μg/mL maca,分别观察细胞培养液中SOD、NOS活性与丙二醛、NO、LDH含量。

1.3 指标与方法 1.3.1 细胞存活率检测

细胞存活率检测采用CCK-8法。取对数生长期的PC12细胞按照每孔1 × 104个密度接种到96孔细胞培养板中,24 h后换无血清培养基进行细胞同步化培养18 h,给予CoCl2处理,每组设8个平行孔,向每孔加入10 μL CCK-8工作液,继续孵育1.5 h。使用酶标仪于450 nm处测定吸光度(A)值,计算细胞存活率。

1.3.2 细胞培养液中抗氧化指标检测

将PC12细胞按照每孔1 × 104个密度接种到96孔细胞培养板中,24 h后换无血清培养基进行细胞同步化培养18 h,分别给予CoCl2与玛咖提取物处理,培养结束后,取细胞培养液检测SOD、NOS活性及丙二醛、NO、LDH含量,严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.3 细胞内NO含量检测

采用荧光探针(DAF-FM DA)法,将对数生长期PC12细胞按照每孔6 × 105个密度接种到6孔细胞培养板中,24 h后换无血清培养基进行细胞同步化培养18 h,给予CoCl2与玛咖提取物处理后,收集细胞,400 g离心5 min,弃上清,磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗3次,加入5 μmol/L DAF-FM DA荧光探针,37 ℃孵育30 min,离心弃上清,PBS洗3次,PBS重悬,流式细胞仪上机检测(激发波长为495 nm,发射波长为515 nm)。

1.3.4 PC12 细胞凋亡率检测

采用annexin V-FITC/PI双染法,将对数生长期PC12细胞按照每孔6 × 105个密度接种到6孔细胞培养板中,24 h后换无血清培养基进行细胞同步化培养18 h,给予CoCl2与玛咖提取物处理后,收集细胞,400 g离心5 min,弃上清,预冷的PBS洗1次,400 g离心5 min,用loading buffer重悬细胞,加入annexin V反应液室温避光孵育10~15 min,加入PI后流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析凋亡情况。凋亡率为早期凋亡与晚期凋亡细胞之和。

1.4 统计分析

数据以 $\overline x $ ± s表示,采用SPSS 11.0软件进行统计分析,组间均数比较采用t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 CoCl2对PC12细胞存活率影响(图12
注:与对照组比较,a P < 0.01。 图 1 不同浓度的CoCl2对PC12细胞存活率影响

注:与对照组比较,a P < 0.01。 图 2 不同作用时间CoCl2对PC12细胞存活率影响

应用200~2 000 μmol/L CoCl2分别作用PC12细胞24 h可致细胞存活率明显降低,呈现一定的剂量效应关系(图1);用300 μmol/L CoCl2作用PC12细胞,随时间的延长,PC12细胞存活率逐渐下降,呈现一定的时间效应关系(图2)。因300 μmol/L CoCl2使PC12细胞存活率降低至对照组的(55.05 ± 5.66) %,故后续实验采用300 μmol/L CoCl2处理PC12细胞24 h作为诱导细胞损伤模型的最佳条件。

2.2 玛咖水提物对PC12细胞存活率影响

结果显示,与对照组(100 %)比较,300 μmol/L CoCl2处理组PC12细胞存活率[(51.55 ± 2.71) %]明显下降,差异有统计学意义(P < 0.01);与CoCl 2组比较,玛咖30、60、120 μg/mL组PC12细胞存活率[分别为(55.07 ± 2.23) %、(63.99 ± 3.24) %、(69.95 ± 2.25) %]明显升高,差异有统计学意义(P < 0.01)。提示,玛咖可有效抑制CoCl 2所致的细胞毒性。

2.3 玛咖水提物对PC12细胞培养液中SOD活性及丙二醛含量影响(表1
表 1 玛咖对PC12细胞培养液中SOD活性及丙二醛含量影响( $\bar x \pm s$ n = 3)

结果显示,与对照组比较,CoCl2组细胞培养液中SOD活性明显降低、丙二醛含量显著增加(P < 0.01);与CoCl 2组比较,玛咖水提物各剂量组PC12细胞培养液中SOD活性显著升高、丙二醛含量明显减少(P < 0.01)。

2.4 玛咖水提物对细胞培养液中LDH漏出量影响

结果显示,对照组、CoCl2组、玛咖低、中、高剂量组PC12细胞内LDH漏出量分别为(712 ± 43)、(1 028 ± 85)、(982 ± 77)、(847 ± 70)、(786 ± 53)U/L;与对照组比较,CoCl2组PC12细胞内LDH漏出量明显升高(P < 0.01);与CoCl 2组比较,中、高剂量玛咖组PC12细胞内LDH漏出量明显减少(P < 0.01)。

2.5 玛咖水提物对细胞内NO含量和细胞培养液中NOS活性影响(表2
表 2 玛咖对PC12细胞内NO含量和细胞培养液中NOS活性及NO含量影响( $\bar x \pm s$ n = 3)

结果显示,与对照组比较,CoCl2组PC12细胞内NO生成增多;与CoCl2组比较,中、高剂量玛咖组PC12细胞内NO含量明显降低。提示,玛咖水提物能抑制CoCl2引起的PC12细胞NO含量升高。与对照组比较,CoCl2组细胞培养液中NOS活性及NO含量明显升高(P < 0.01);与CoCl 2组比较,玛咖中、高剂量组PC12细胞培养液中NO含量和NOS活性增加(P < 0.05)。

2.6 玛咖水提物对PC12细胞凋亡率影响

结果显示,对照组、CoCl2组、玛咖低、中、高剂量组PC12细胞凋亡率分别为(12.00 ± 1.49) %、(41.33 ± 3.83) %、(39.80 ± 2.76) %、(34.87 ± 2.50) %、(31.33 ± 3.44) %;与对照组比较,CoCl2组PC12细胞凋亡率明显升高(P < 0.05);与CoCl 2组比较,玛咖高剂量组PC12细胞凋亡率明显下降(P < 0.05)。

3 讨 论

本研究结果显示,在200~2 000 μmol/L 浓度范围内,CoCl2呈时间 – 浓度依赖性降低PC12细胞存活率;300 μmol/L CoCl 2诱导PC12细胞24 h,细胞培养液中SOD活性降低,丙二醛及LDH含量升高,NOS活性及NO的含量明显升高;500 μmol/L CoCl2诱导PC12细胞24 h,细胞内NO含量明显升高,细胞凋亡率明显增加。与已有研究结果一致[68]。缺氧导致细胞膜损伤时,细胞内LDH外漏,导致培养基中LDH活性升高,测定LDH酶活性可以反映细胞的损伤程度[9]。本研究结果显示,玛咖水提物可以不同程度的减少CoCl2致PC12细胞培养液中LDH漏出。提示,玛咖水提物可以保护缺氧PC12细胞膜的完整性。

SOD是超氧化物的天然清除剂,主要通过歧化的方式清除超氧阴离子自由基,增强细胞的抗氧化损伤能力,减轻神经元损伤[10]。丙二醛是脂质过氧化最终产物之一,通常作为评价脂质过氧化的指标[11]。在正常情况下,一定浓度的NO对于维持体内氧化还原平衡和细胞增殖起着重要作用,当CoCl2作用PC12细胞致缺氧时,细胞内NO含量增加,NO与超氧阴离子快速反应生成过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO-)及过氧亚硝酸根离子(ONOOH),后者对生物系统的毒性比NO更强[12],可介导多种细胞损伤。同时,过氧亚硝基阴离子可氧化NOS的辅助因子四氢生物蝶呤,使其不足而促进eNOS解偶联,解偶联的eNOS产生超氧化物而不是NO,而存在超氧化物时,又可使NO迅速失活生成过氧亚硝基阴离子,形成恶性循环加重细胞损伤[1314]

本研究结果显示,CoCl2能增加PC12细胞NOS活性及NO的生成,诱导细胞损伤,降低细胞存活率,使凋亡细胞数目增加。与已有研究结果[15]一致。提示,NO通路可能是化学性缺氧剂CoCl2损伤PC12细胞的重要机制之一。本研究结果还显示,玛咖水提物能明显地抑制CoCl2诱导的细胞损伤,使细胞存活率增加,凋亡细胞数目减少,降低NOS活性,减少NO合成,提高SOD活力,减少MDA产生。提示,玛咖水提物可通过抑制NO通路保护PC12细胞对抗化学性低氧引起的损伤。

参考文献
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