2. 滨州市滨城区市立医院
玛咖(maca)为十字花科独行菜属植物(Lepidium meyenii Walp)的根茎,是印加人重要的食物来源之一。2003年在我国云南丽江引种成功[1]。研究证实,玛咖可增强免疫力、提高生育力、改善性功能、治疗女性更年期综合征等[2 – 3],玛咖具有抗疲劳及抗氧化作用[4];玛咖具有清除自由基,提高细胞抗氧化能力功效[5]。本研究采用二氯化钴(cobalt chloride,CoCl2),一种常用的化学性低氧模拟剂损伤具有神经元形态和功能特征、来源于大鼠嗜铬细胞瘤的PC12细胞,建立化学性缺氧损伤模型,探讨玛咖拮抗CoCl2引起的PC12细胞缺氧损伤作用及机制。结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器采集云南产玛咖鲜根,低温干燥后粉碎,过60目筛获得玛咖粉;玛咖提取物采用玛咖粉为原料,用水提取,浓缩并烘成干浸膏,低温避光密封保存,1 g玛咖提取物约相当于3 g生药。CoCl2(美国Sigma公司),DAF-FM DA(上海碧云天生物技术有限公司),annexin V-FITC/PI(美国eBioscience公司),cell counting kit-8(CCK-8)细胞增殖检测试剂盒(日本Dojindo公司),DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)培养基、胎牛血清、谷氨酰胺、胰酶(美国Gibico公司),Hanks液、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。FACS流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司);SPECTRAMAX plus酶标仪(美国Molecular Devices公司);CO2培养箱(德国Thermo公司)。
1.2 细胞培养与分组大鼠肾上腺嗜铬瘤(PC12)细胞(中科院上海细胞库)接种于体积分数为10 %胎牛血清的DMEM培养基,于37 ℃、5 % CO2的细胞培养箱中培养,选取对数生长期细胞进行实验。将PC12细胞分为0(对照组)、200、300、400、500、600、800、1 000、2 000 μmol/L共9组,采用CoCl2处理24 h,观察量 – 效关系;采用300 μmol/L CoCl 2处理PC12 细胞0(对照组)、12、24、36、48、60 h,观察时 – 效关系;将PC12细胞分为对照组、CoCl 2组[应用300 μmol/L CoCl2处理细胞24 h(在细胞内NO测定及细胞凋亡率实验中,应用500 μmol/L CoCl2处理细胞24 h)]、maca低、中、高剂量组(CoCl2处理细胞前3 h,分别加入30、60、120 μg/mL maca,分别观察细胞培养液中SOD、NOS活性与丙二醛、NO、LDH含量。
1.3 指标与方法 1.3.1 细胞存活率检测细胞存活率检测采用CCK-8法。取对数生长期的PC12细胞按照每孔1 × 104个密度接种到96孔细胞培养板中,24 h后换无血清培养基进行细胞同步化培养18 h,给予CoCl2处理,每组设8个平行孔,向每孔加入10 μL CCK-8工作液,继续孵育1.5 h。使用酶标仪于450 nm处测定吸光度(A)值,计算细胞存活率。
1.3.2 细胞培养液中抗氧化指标检测将PC12细胞按照每孔1 × 104个密度接种到96孔细胞培养板中,24 h后换无血清培养基进行细胞同步化培养18 h,分别给予CoCl2与玛咖提取物处理,培养结束后,取细胞培养液检测SOD、NOS活性及丙二醛、NO、LDH含量,严格按照试剂盒说明书操作。
1.3.3 细胞内NO含量检测采用荧光探针(DAF-FM DA)法,将对数生长期PC12细胞按照每孔6 × 105个密度接种到6孔细胞培养板中,24 h后换无血清培养基进行细胞同步化培养18 h,给予CoCl2与玛咖提取物处理后,收集细胞,400 g离心5 min,弃上清,磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗3次,加入5 μmol/L DAF-FM DA荧光探针,37 ℃孵育30 min,离心弃上清,PBS洗3次,PBS重悬,流式细胞仪上机检测(激发波长为495 nm,发射波长为515 nm)。
1.3.4 PC12 细胞凋亡率检测采用annexin V-FITC/PI双染法,将对数生长期PC12细胞按照每孔6 × 105个密度接种到6孔细胞培养板中,24 h后换无血清培养基进行细胞同步化培养18 h,给予CoCl2与玛咖提取物处理后,收集细胞,400 g离心5 min,弃上清,预冷的PBS洗1次,400 g离心5 min,用loading buffer重悬细胞,加入annexin V反应液室温避光孵育10~15 min,加入PI后流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析凋亡情况。凋亡率为早期凋亡与晚期凋亡细胞之和。
1.4 统计分析数据以
应用200~2 000 μmol/L CoCl2分别作用PC12细胞24 h可致细胞存活率明显降低,呈现一定的剂量效应关系(图1);用300 μmol/L CoCl2作用PC12细胞,随时间的延长,PC12细胞存活率逐渐下降,呈现一定的时间效应关系(图2)。因300 μmol/L CoCl2使PC12细胞存活率降低至对照组的(55.05 ± 5.66) %,故后续实验采用300 μmol/L CoCl2处理PC12细胞24 h作为诱导细胞损伤模型的最佳条件。
2.2 玛咖水提物对PC12细胞存活率影响结果显示,与对照组(100 %)比较,300 μmol/L CoCl2处理组PC12细胞存活率[(51.55 ± 2.71) %]明显下降,差异有统计学意义(P < 0.01);与CoCl 2组比较,玛咖30、60、120 μg/mL组PC12细胞存活率[分别为(55.07 ± 2.23) %、(63.99 ± 3.24) %、(69.95 ± 2.25) %]明显升高,差异有统计学意义(P < 0.01)。提示,玛咖可有效抑制CoCl 2所致的细胞毒性。
2.3 玛咖水提物对PC12细胞培养液中SOD活性及丙二醛含量影响(表1)结果显示,与对照组比较,CoCl2组细胞培养液中SOD活性明显降低、丙二醛含量显著增加(P < 0.01);与CoCl 2组比较,玛咖水提物各剂量组PC12细胞培养液中SOD活性显著升高、丙二醛含量明显减少(P < 0.01)。
2.4 玛咖水提物对细胞培养液中LDH漏出量影响结果显示,对照组、CoCl2组、玛咖低、中、高剂量组PC12细胞内LDH漏出量分别为(712 ± 43)、(1 028 ± 85)、(982 ± 77)、(847 ± 70)、(786 ± 53)U/L;与对照组比较,CoCl2组PC12细胞内LDH漏出量明显升高(P < 0.01);与CoCl 2组比较,中、高剂量玛咖组PC12细胞内LDH漏出量明显减少(P < 0.01)。
2.5 玛咖水提物对细胞内NO含量和细胞培养液中NOS活性影响(表2)结果显示,与对照组比较,CoCl2组PC12细胞内NO生成增多;与CoCl2组比较,中、高剂量玛咖组PC12细胞内NO含量明显降低。提示,玛咖水提物能抑制CoCl2引起的PC12细胞NO含量升高。与对照组比较,CoCl2组细胞培养液中NOS活性及NO含量明显升高(P < 0.01);与CoCl 2组比较,玛咖中、高剂量组PC12细胞培养液中NO含量和NOS活性增加(P < 0.05)。
2.6 玛咖水提物对PC12细胞凋亡率影响结果显示,对照组、CoCl2组、玛咖低、中、高剂量组PC12细胞凋亡率分别为(12.00 ± 1.49) %、(41.33 ± 3.83) %、(39.80 ± 2.76) %、(34.87 ± 2.50) %、(31.33 ± 3.44) %;与对照组比较,CoCl2组PC12细胞凋亡率明显升高(P < 0.05);与CoCl 2组比较,玛咖高剂量组PC12细胞凋亡率明显下降(P < 0.05)。
3 讨 论本研究结果显示,在200~2 000 μmol/L 浓度范围内,CoCl2呈时间 – 浓度依赖性降低PC12细胞存活率;300 μmol/L CoCl 2诱导PC12细胞24 h,细胞培养液中SOD活性降低,丙二醛及LDH含量升高,NOS活性及NO的含量明显升高;500 μmol/L CoCl2诱导PC12细胞24 h,细胞内NO含量明显升高,细胞凋亡率明显增加。与已有研究结果一致[6 – 8]。缺氧导致细胞膜损伤时,细胞内LDH外漏,导致培养基中LDH活性升高,测定LDH酶活性可以反映细胞的损伤程度[9]。本研究结果显示,玛咖水提物可以不同程度的减少CoCl2致PC12细胞培养液中LDH漏出。提示,玛咖水提物可以保护缺氧PC12细胞膜的完整性。
SOD是超氧化物的天然清除剂,主要通过歧化的方式清除超氧阴离子自由基,增强细胞的抗氧化损伤能力,减轻神经元损伤[10]。丙二醛是脂质过氧化最终产物之一,通常作为评价脂质过氧化的指标[11]。在正常情况下,一定浓度的NO对于维持体内氧化还原平衡和细胞增殖起着重要作用,当CoCl2作用PC12细胞致缺氧时,细胞内NO含量增加,NO与超氧阴离子快速反应生成过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO-)及过氧亚硝酸根离子(ONOOH),后者对生物系统的毒性比NO更强[12],可介导多种细胞损伤。同时,过氧亚硝基阴离子可氧化NOS的辅助因子四氢生物蝶呤,使其不足而促进eNOS解偶联,解偶联的eNOS产生超氧化物而不是NO,而存在超氧化物时,又可使NO迅速失活生成过氧亚硝基阴离子,形成恶性循环加重细胞损伤[13 – 14]。
本研究结果显示,CoCl2能增加PC12细胞NOS活性及NO的生成,诱导细胞损伤,降低细胞存活率,使凋亡细胞数目增加。与已有研究结果[15]一致。提示,NO通路可能是化学性缺氧剂CoCl2损伤PC12细胞的重要机制之一。本研究结果还显示,玛咖水提物能明显地抑制CoCl2诱导的细胞损伤,使细胞存活率增加,凋亡细胞数目减少,降低NOS活性,减少NO合成,提高SOD活力,减少MDA产生。提示,玛咖水提物可通过抑制NO通路保护PC12细胞对抗化学性低氧引起的损伤。
[1] | 李磊, 周昇昇. 玛咖的食品营养与安全评价及开发前景[J]. 食品工业科技, 2012, 33(5): 376–379. |
[2] | Lee MS, Shin BC, Yang EJ, et al. Maca (Lepidium meyenii) for treatment of menopausal symptoms: a systematic review [J]. Maturitas, 2011, 70(3): 227–233. DOI:10.1016/j.maturitas.2011.07.017 |
[3] | Gonzales GF, Cordova A, Gonzales C, et al. Lepidium meyenii (Maca) improved semen parameters in adult men [J]. Asian Journal of Andrology, 2001, 3(4): 301–303. |
[4] | 张静, 李慧, 周雯, 等. 玛咖粉对小鼠的抗疲劳作用及其机制研究[J]. 卫生研究, 2013, 42(6): 1046–1049. |
[5] | Vecera R, Orolin J, Skottová N, et al. The influence of Maca (Lepidium meyenii) on antioxidant status, lipid and glucose metabolism in rat [J]. Plant Foods for Hum Nutr, 2007, 62(2): 59–63. DOI:10.1007/s11130-007-0042-z |
[6] | Liu B, Yang P, Ye Y, et al. Role of ROS in the protective effect of silibinin on sodium nitroprusside-induced apoptosis in rat pheochromocytoma PC12 cells[J]. Free Radic Res, 2011, 45(7): 835–847. DOI:10.3109/10715762.2011.580343 |
[7] | 曾季平, 王立祥, 胡晓燕, 等. 氯化钴诱导 PC12 细胞凋亡的分子机制[J]. 毒理学杂志, 2005, 19(3): 193–195. DOI:10.3969/j.issn.1002-3127.2005.03.042 |
[8] | 曾克武, 王学美, 富宏, 等. 金丝桃苷对氯化钴所致的PC12细胞损伤模型的保护作用和机制研究[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(17): 2409–2412. |
[9] | 姚娟, 马慧萍, 杨燕, 等. 缺氧环境对 PC12 细胞损伤及HIF-1m RNA 表达水平的影响[J]. 中国药理学通报, 2011, 27(2): 162–166. |
[10] | Petrik MS, Wilson JM, Grant SC, et al. Magnetic resonance microscopy and immunohistochemistry of the CNS of the mutant SOD murine model of ALS reveals widespread neural deficits[J]. Neuromolecular Med, 2007, 9(3): 216–229. DOI:10.1007/s12017-007-8002-1 |
[11] | Kowalczuk K, Stryjecka-Zimmer M. The influence of oxidative stress on the level of malondialdehyde (MDA) in different areas of the rabbit brain[J]. Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska, 2002, 57(2): 160–164. |
[12] | Ferdinandy P, Danial H, Ambrus I, et al. Peroxynitrite is a major contributor to cytokine-induced myocardial contractile failure[J]. Circ Res, 2000, 87(3): 241–247. DOI:10.1161/01.RES.87.3.241 |
[13] | Mitra S, Goyal T, Mehta JL. Oxidized LDL, LOX-1 and aterosclerosis[J]. Cardiovascular Drugs and Therapy, 2011, 25(5): 419–429. DOI:10.1007/s10557-011-6341-5 |
[14] | Gielis JF, Lin JY, Wingler K, et al. Pathogenetic role of eNOS un-coupling in cardiopulmonary disorders[J]. Free Radic Biol Med, 2011, 50(7): 765–776. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2010.12.018 |
[15] | 廖新学, 阮经文, 兰爱平, 等. p38 MAPK-iNOS-NO通路介导化学性缺氧对PC12细胞的损伤作用[J]. 中国病理生理杂志, 2010, 26(12): 2410–2414. |