阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)临床表现为认知、学习及记忆功能的进行性损伤。线粒体参与调控的神经细胞凋亡过程是AD发病的重要环节,而线粒体的分裂融合与细胞凋亡密切相关。目前治疗AD的药物均具有一定的副作用[1],寻求植物化学物防治AD成为研究热点,茶多酚和原花青素是天然存在于植物体内的具有多个酚基团的化合物,具有抗氧化、抗炎等生物学作用[2]。大量研究表明茶多酚和原花青素能增强AD相关动物及细胞模型抗氧化能力,减少活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生,改善AD动物模型记忆能力[3 – 4]。但对两者联合作用研究较少。研究表明去卵巢合并D-半乳糖腹腔注射大鼠出现典型的AD病理改变及学习记忆能力减退[5 – 6]。本研究采用去卵巢合并D – 半乳糖腹腔注射建立AD模型,以维生素E(vitamin E, V E)作为阳性对照组,观察茶多酚和原花青素单独及联合干预对大鼠海马组织线粒体凋亡途径关键蛋白B细胞淋巴瘤/白血病 – 2蛋白(B-cell leukemia/lymphoma 2, Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白细胞基因伴随蛋白x(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达及线粒体分裂融合蛋白动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、视神经症萎缩症蛋白1(optic dominant atrophy 1,Opa1)表达的影响,进一步探索茶多酚和原花青素在AD记忆改善中可能的作用机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器茶多酚、原花青素(西安和霖生物工程有限公司,纯度 ≥ 98 %);D-半乳糖(美国Amreso公司);Bcl-2、Bax抗体(美国abcam公司);Drp1抗体(美国GeneTex公司);Opa1抗体(武汉博士德公司)。穿梭箱实验箱(荷兰Noldus公司);透射电镜(日本JEOL电子株式会社)。
1.2 实验动物及分组SPF级3~4月龄Wistar雌性大鼠60只,由中国食品药品检定研究院提供,许可证号:SCXK(京)2014 – 0013。室温(25 ± 2) ℃,湿度(60 ± 10) %,自然采光,自由摄食、饮水。适应性喂养1周后,按体重随机分为假手术组、模型组、茶多酚组(150 mg/kg)、原花青素组(100 mg/kg),茶多酚 + 原花青素组(茶多酚150 mg/kg + 原花青素100 mg/kg),维生素E组(60 mg/kg),每组10只。除假手术组外,其它各组大鼠施双侧卵巢摘除术。术后恢复1周,除假手术组,其它各组每天给予D – 半乳糖(100 mg/kg)腹腔注射。同时,茶多酚组、原花青素组,茶多酚 + 原花青素组大鼠灌胃给予受试物,模型组与假手术组灌胃等量蒸馏水,连续12周,每周记录1次体重并根据体重调整灌胃量与注射量。
1.3 指标与方法 1.3.1 穿梭箱实验箱体为封闭的长方形盒子,两室之间有拱门相通,箱底有可通电的铜栅。把大鼠放入穿梭箱左侧室,适应2 min后开始训练。穿梭箱实验视频分析系统按照预先设好的程序,先给5 s 2 200 Hz的蜂鸣音,若大鼠在蜂鸣音刺激中就移动到了穿梭箱另一侧,记为一次主动回避;若未移动,继续产生1.0 mA的交流电击,最长持续10 s,若在电击刺激时移动到另一侧记为被动回避;若电击刺激仍没有到另一侧,则记为无反应。每天每只大鼠连续训练10个循环,每次间隔15 s。连续实验5 d,前4 d为训练,第5天为测试。记录大鼠回避潜伏时间(从条件刺激开始到逃至对侧的时间)、主动回避反应率(每天完成主动回避反应的次数与每天测试总次数的比值)和总回避反应率(每天完成回避反应的次数与每天测试总次数的比值)评价主动及被动回避能力。
1.3.2 神经元细胞核和线粒体超微结构观察采用电镜法,行为学测试结束后,每组随机取3只大鼠进行心脏灌流,取1 mm3海马CA1区组织,利用含有0.2 %戊二醛的4 %多聚甲醛固定液灌流固定海马,后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)洗涤3次,每次5 min;梯度浓度的酒精、丙酮依次脱水;超薄切片,醋酸铀及柠檬酸染色,透射电镜下观察海马神经细胞核和线粒体超微结构的改变。
1.3.3 大鼠海马组织中Bcl-2、Bax、Drp1及Opa1蛋白表达检测采用Western blot法,取冷冻海马组织称重,蛋白裂解后使用BCA(bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量;取蛋白样品进行电泳,将蛋白转至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜;用含5 %脱脂奶粉的封闭液室温下封闭2 h后,按要求分别加入稀释比例为1 : 1000的抗Bcl-2、Drp1及Opa1抗体、稀释比例为1 : 500的抗Bax抗体,4 ℃孵育过夜。按1 : 5 000稀释二抗,室温下孵育1 h。ECL(electrochemiluminescence)化学发光显色液进行曝光,LabWorks软件对图像进行灰度分析。
1.4 统计分析数据采用
穿梭箱结果表明,与假手术组比较,模型组大鼠回避潜伏时间延长,主动回避反应率和总回避反应率降低(P < 0.05);与模型组比较,V E组大鼠回避潜伏时间明显缩短(P < 0.05),茶多酚组、原花青素组和茶多酚 + 原花青素组大鼠回避潜伏时间明显缩短( P < 0.01),茶多酚组、原花青素组及V E组大鼠主动回避反应率和总回避反应率升高(P < 0.05);与茶多酚和原花青素组比较,茶多酚 + 原花青素组大鼠回避潜伏时间缩短,主动回避反应率升高( P < 0.05)。
2.2 茶多酚和原花青素对细胞核和线粒体超微结构影响 2.2.1 茶多酚和原花青素对细胞核超微结构影响(图1)电镜结果显示,假手术组大鼠神经细胞核膜结构完整、平滑,双层膜结构清晰,核内染色质均匀,电子密度低(图1A);模型组神经元核膜破裂,核内染色质聚集成团、边集,形成不规则的高电子密度团块,成新月状,附在核膜周边(图1B);茶多酚、原花青素组和VE组大鼠神经细胞核结构有所改善,但仍可见核染色质边移(图1C、D、F);联合干预组恢复更为明显(图1E)。
2.2.2 茶多酚和原花青素对神经细胞线粒体超微结构影响(图2)结果显示,假手术组大鼠神经元线粒体数量多,形态正常,嵴清晰可见(图2A);模型组大鼠神经元线粒体肿胀,空泡样变严重,线粒体嵴变短变小甚至消失(图2B);茶多酚、原花青素组和VE组大鼠神经元线粒体结构有所改善(图2C、D、F);联合干预组恢复更为明显(图2E)。
2.3 茶多酚和原花青素对大鼠海马组织Bax和Bcl-2蛋白表达影响(图3、表2)与假手术组比较,模型组大鼠海马组织中Bax蛋白表达明显上调,Bcl-2蛋白表达下调,Bcl-2/Bax降低(P < 0.05);与模型组比较,茶多酚组、原花青素组、茶多酚 + 原花青素组和V E组大鼠海马组织Bax蛋白表达明显下调,Bcl-2/Bax升高(P < 0.01);与茶多酚组比较,茶多酚 + 原花青素组大鼠海马组织Bax蛋白表达明显下调( P < 0.05)。
2.4 茶多酚和原花青素对大鼠海马组织Drp1和Opa1蛋白表达影响(图4、表3)与假手术组比较,模型组大鼠海马组织Drp1蛋白表达明显上调,Opa1蛋白表达下调(P < 0.05);与模型组比较,茶多酚组、V E组大鼠海马组织Drp1蛋白表达下调,Opa1蛋白表达上调(P < 0.05),原花青素组和茶多酚 + 原花青素组大鼠海马组织Drp1蛋白表达明显下调,Opa1蛋白表达明显上调( P < 0.01)。
3 讨 论穿梭箱实验由于可同时观察主动和被动回避反应,因而在行为学实验中较为常用[7]。本研究结果显示,与对照组比较,模型组大鼠回避潜伏时间延长,主动回避反应率和总回避反应率降低;与模型组比较,茶多酚组、原花青素组、茶多酚 + 原花青素组大鼠回避潜伏时间明显缩短,主动回避反应率和总回避反应率升高,联合干预组比单独干预组改善效果更为显著。提示,茶多酚和原花青素可改善AD大鼠的学习记忆能力。
AD的重要病理学特征之一是神经元丢失,而病理性的细胞凋亡是导致神经元丢失的重要原因。凋亡细胞的特征性形态改变是核染色质凝聚,通常被描述为“核染色质边移”[8]。Bcl-2家族蛋白介导的线粒体凋亡途径在细胞凋亡中发挥重要作用,Bcl-2/Bax的比值被称为“细胞凋亡的分子开关”,其比值高低直接决定线粒体介导的细胞凋亡是否启动[9]。本研究结果显示,模型组大鼠神经元核膜破裂,核内染色质聚集成团、边集,线粒体肿胀,空泡样变严重,线粒体嵴变短变小甚至消失,出现细胞凋亡典型特征;茶多酚组、原花青素组大鼠神经元结构有所改善,但仍可见核染色质边移;与假手术组比较,模型组大鼠Bax蛋白表达明显上调,Bcl-2蛋白表达下调,Bcl-2/Bax降低;与模型组比较,茶多酚组、原花青素组Bax蛋白表达下调,Bcl-2/Bax的比值升高。这与已有研究结果[10 – 11]一致。提示,茶多酚和原花青素均可通过调节Bcl-2及Bax表达,减少神经元细胞的凋亡。
近年来研究表明,在细胞凋亡早期,即可观察到线粒体网络结构的片段化。线粒体形态的调控分子参与了细胞凋亡,调控凋亡的分子也会明显改变线粒体的形态[12]。线粒体是高度动态变化的细胞器,其形态的维持依靠不断地分裂融合[13]。本研究结果显示,模型组大鼠海马组织中Drp1蛋白表达上调,Opa1蛋白表达下调;茶多酚和原花青素组大鼠海马组织Drp1蛋白表达均明显下调,Opa1蛋白表达明显上调。研究显示,Bax基因的表达可以加速凋亡过程中线粒体从网管状向点状表型的转换,同时诱导Drp1蛋白的表达和再分布。若诱导凋亡前抑制Drp1的活性不仅抑制线粒体分裂,而且延缓caspase的激活和细胞凋亡过程[14 – 15]。因此,推测模型组大鼠海马组织中Drp1蛋白表达上调,促进线粒体分裂,进一步诱导细胞凋亡;而Bax的上调又会诱导Drp1表达,而茶多酚和原花青素可以通过调节线粒体的分裂融合,进一步影响细胞凋亡。
综上所述,茶多酚和原花青素在不同的AD动物模型中对记忆的改善作用均与线粒体凋亡途径及线粒体的分裂融合密切相关[16 – 17]。茶多酚和原花青素对记忆的改善作用存在交叉或共同的信号通路,联合作用可以提高其生物利用率和抗氧化能力、促进线粒体融合、增强抗凋亡作用,使神经元损伤有所恢复,进而起到记忆改善作用。
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