2019, Vol. 35
2. 温州医科大学眼视光学院
无机砷是确认的致癌物[1]，人类可通过饮用水、食物和空气等多种途径暴露于无机砷[2]。长期暴露于高浓度的无机砷可导致慢性砷中毒，引起多器官和系统病变。研究发现，慢性砷中毒以皮肤损伤较为常见，多表现为皮肤色素脱失、色素沉着、掌拓部皮肤角化，严重者可发生癌变[3]。砷暴露所致皮肤损伤（arsenic-induced skin lesion，AISL）被普遍认为是慢性砷中毒的一个重要指标[4]，对于砷致健康损害包括癌症研究具有重要的意义。甲基化代谢是无机砷在体内的关键代谢环节，慢性砷中毒与多种基因和环境因素密切相关[5]。既往研究多见于单纯从遗传学角度探讨基因多态性对无机砷甲基化代谢的影响，或以环境因素为主要切入点研究2者间关系，已有的基因-环境交互作用研究也多局限于单因素分析或2者间的一级交互作用[6]。本研究使用多因子降维法（multifactorial dimensionality reduction，MDR）和多元岭回归模型，探讨基因、环境及其多级交互作用与AISL发生风险间的关联性，旨在为进一步阐明慢性砷中毒发生发展机制提供依据。
1 对象与方法 1.1 对象来自于2010年9月到2011年12月实施的一项随机、双盲和安慰剂对照的临床试验的基线数据[7]。以内蒙古自治区巴彦淖尔市五原县为研究地点，根据历年饮用水砷浓度进行分层整群抽样后，随机选取其中3个自然村为调查点，共有450人符合本研究的纳入标准，对其中的335人进行了DNA提取与基因分型。同时对每位参与者进行流行病学调查和临床体检，砷暴露时间的确定根据研究对象报告的饮用高砷地下水的时间。AISL诊断由专业医生参照地方性砷中毒诊断标准（WS/T211 – 2001） [8]完成，最终65例受试者被诊断患有AISL，余下270人为对照组。研究方案通过温州医科大学伦理委员会的审批，所有受试人员均签署知情同意书。
1.2 样本采集研究对象空腹10～12 h后，使用乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管抽取静脉血5 mL，同步收集尿样20 mL。血、尿样品于30 min之内分离，并置于0 ℃冰盒保存，2 h内置于–86 ℃冰箱冻存待测。
1.3 指标与方法 1.3.1 基因型检测采用美国QIAGEN公司生产的FlexiGene DNA提取试剂盒提取外周静脉血白细胞DNA，采用MassARRAY®分子量阵列平台的iPLEX Gold技术（美国Agena Bioscience公司），通过MassARRAY Typer Analyzer v 4软件对选取的基因位点进行基因型分析。
1.3.2 尿砷代谢物分析采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用系统，对尿液中各种砷代谢物进行分离和检测，并进行尿肌酐校正。尿砷代谢物主要包括无机砷[inorganic arsenic，iAs（iAsⅢ + iAsⅤ）]，单甲基胂酸[monomethylarsonic acid，MMA（MMAⅢ + MMAⅤ）]和二甲基胂酸[dimethylarsinic acid，DMA（DMAⅢ + DMAⅤ）]。
1.3.3 尿砷代谢物与AISL关联性分析为充分探索暴露时间、尿iAs、MMA和DMA水平与AISL风险间的关系，采用2种方法：（1）三等分，第一分位数到第三分位数分别设定为低、中、高暴露，采用哑变量方法分析各环境因素水平与AISL的相关性；（2）采用四分位数间距进行分组，探讨每增加1个四分位间距与AISL风险间的线性关系。
1.4 统计分析采用stata/MP 15.1统计软件，以χ2和Wilcoxon秩和检验分别比较人口学特征和相关临床指标的组间差异。对As3MT和N6AMT1基因的14个位点进行Hardy-Weinberg平衡检验，确定样本的群体代表性；采用单因素非条件logistic回归模型分析基因及环境因素与AISL的关联性。采用MDR 0.5.1软件多因子降维法（MDR）分析基因多位点与环境因素的联合作用模式，多元岭回归模型分析基因与环境因素及其交互作用与AISL的关联性。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 一般人口学和临床特征（表1）
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表 1 一般人口学和基本临床特征比较a |
本研究共调查335人，平均年龄（50.59 ± 11.24）岁，男女性别比例为1 : 1.54；2组人群在性别构成、吸烟、饮酒、体质指数、血清总胆固醇、空腹血糖和血压水平等方面差异均无统计学意义（P > 0.05）。
2.2 砷暴露时间及尿砷代谢物与AISL关联性（表2）|
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表 2 砷暴露时间及尿砷代谢物与AISL的关联性分析 |
长暴露时间人群患AISL风险是短暴露时间人群的2.31倍（P = 0.020），高水平尿DMA人群患AISL风险是低水平者的2.13倍（P = 0.032）。暴露时间每增加一个四分位数间距（ interquartile range，IQR），AISL患病风险平均增加41 %（P = 0.069），尿DMA水平每增加一个IQR，AISL患病风险平均增加24 %（P = 0.167）。
2.3 基因多态性与AISL关联性（表3）|
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表 3 As3MT、N6AMT1基因与AISL关联性分析 |
本研究中As3MT基因5个位点（除rs1191439）和N6AMT1基因8个位点等位基因频率在病例组和对照组均符合Hardy-Weinberg平衡（P > 0.05）。非条件logistic回归分析结果显示，N6AMT1基因rs1006903位点GC/CC基因型个体患皮肤损伤的风险是GG个体的1.78倍（ P = 0.039）。病例组与对照组之间其余12个位点基因型分布频率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.4 基因-环境因素交互作用与AISL风险关联性（表4）|
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表 4 基因-环境交互作用与AISL的多因子降维模型 |
结果显示，最优模型为含3个因子的模型（rs3740400，iAS，MMA），精度和可预测的患AISL风险均较高。该模型为As3MT基因与环境因素的联合作用模式，其检验样本的误差最小（1 – 0.577 6 = 0.422 4），交叉验证一致率为9/10，总样本的χ2检验具有统计学意义（P < 0.001），但是检验样本的 χ2检验未达到显著性水平，可能是由于样本量较小的原因。
2.5 基因及环境因素与AISL风险关联性的岭回归分析（表5）|
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表 5 基因型、环境及基因 – 环境交互作用与AISL关联性的岭回归分析 |
结果显示，携带As3MT基因的rs3740400位点CA/AA基因型个体、N6AMT1基因rs1006903位点GC/CC基因型、尿DMA水平较高为AISL的危险因素（P < 0.05）。暴露时间与DMA的交互作用（ P = 0.002）及rs3740400-iAS-MMA相互作用（P = 0.024）与AISL之间具有统计学关联。
3 讨 论砷代谢产物的形态和价态在其毒性和致癌作用中起重要作用，进入体内的iAs主要在肝脏内进行甲基化代谢，最终生成MMA和DMA并随尿液、唾液等途径排出体外。尿中iAs、MMA、DMA的水平是评估人体砷摄入量重要的生物标志物。研究表明砷暴露水平与皮肤损伤的发生风险密切相关[9]。尿液中的MMA、DMA浓度随着砷暴露时间和浓度增加而增加，并与皮肤损伤呈正相关[10]。这与本研究结果AISL患者尿DMA水平较高相一致。
As3MT在砷甲基化代谢过程中起关键作用，其基因多态性导致砷在体内的代谢效率和代谢产物的组成存在差异而影响其疾病的易感性。突变基因型往往与较高的尿MMA %，iAs %及较低DMA %相关[11 – 12]，这种尿砷代谢物模式可能增加AISL的易感性[13]。N6AMT1作为一种新型的甲基转移酶也参与体内砷代谢过程[14]；N6AMT1基因多态性与砷甲基化代谢能力存在相关性而且这种作用独立于As3MT[15]。尽管在表达量相当情况下它的作用效果与As3MT相比显得相对有限，但它仍然是砷甲基化代谢的重要补充[16]。N6AMT1基因多个位点基因型与尿iAs %，MMA %和DMA %之间存在关联性[17]。这可能是本研究中发现的As3MT基因rs3740400位点及N6AMT1基因rs1006903位点与AISL相关联的原因之一。
研究表明As3MT基因多态性可通过增加砷甲基化能力，提高砷的代谢效率，从而减少环境砷暴露对健康的影响[6]。MDR作为一种分析基因-基因/环境交互作用的方法，它弥补了logistic回归在处理高阶交互作用时的局限性。在恶性肿瘤[18]、精神分裂症[19]等复杂疾病研究中应用广泛，但其不能发现主效应。岭回归模型通过将修正系数 λ 和经典logistic回归模型相结合，不但可以发现主效应，也能很好的处理变量间的共线性问题，而且模型中变量的数目受样本量大小影响较小，同时更适用于多因素交互作用或高阶交互作用的分析。本研究结果显示，携带As3MT基因rs3740400位点CA/AA基因型、N6AMT1基因rs1006903位点GC/CC基因型和尿DMA水平升高可增加AISL的风险性。rs3740400基因型，尿iAs和MMA的交互作用是AISL患病风险的重要影响因素。
本研究的优势是所选的研究对象均来自于饮水型砷暴露地区，且全为农民，其迁移率小，对遗传研究的影响小，一定程度上可保证研究的准确性。同时，本研究分析了2个基因多个位点的突变情况，并且采用2种模型进行基因与环境因素的交互作用分析，获得相似的结果，反映了研究结果的稳定性。然而，由于尿砷代谢物水平的测定，没有考虑砷的外暴露及其他机体代谢差异的影响，可能会影响尿砷代谢物与AISL之间的关联。
综上所述，As3MT、N6AMT1基因多态性均与AISL的患病风险具有关联性，另外As3MT基因rs3740400位点与尿iAS、MMA的交互作用也是AISL患病风险重要影响因素。
| [1] | Smith AH, Lopipero PA, Bates MN, et al. Public health. Arsenic epidemiology and drinking water standards[J]. Science, 2002, 296(5576): 2145–2146. DOI:10.1126/science.1072896 |
| [2] | Sun GF. Arsenic contamination and arsenicosis in China[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2004, 198(3): 268–271. DOI:10.1016/j.taap.2003.10.017 |
| [3] | Jomova K, Jenisova Z, Feszterova M, et al. Arsenic: toxicity, oxidative stress and human disease[J]. Journal of Applied Toxicology, 2011, 31(2): 95–107. |
| [4] | Hsu LI, Chen GS, Lee CH, et al. Use of arsenic-induced palmoplantar hyperkeratosis and skin cancers to predict risk of subsequent internal malignancy[J]. American Journal of Epidemiology, 2013, 177(3): 202–212. DOI:10.1093/aje/kws369 |
| [5] | Paul S, Majumdar S, Giri AK. Genetic susceptibility to arsenic-induced skin lesions and health effects: a review[J]. Genes and Environment: the Official Journal of the Japanese Environmental Mutagen Society, 2015, 37: 23. |
| [6] | Pierce BL, Tong L, Argos M, et al. Arsenic metabolism efficiency has a causal role in arsenic toxicity: mendelian randomization and gene-environment interaction[J]. Int J Epidemiol., 2013, 42(6): 1862–1872. DOI:10.1093/ije/dyt182 |
| [7] | Guo XJ, Cui H, Zhang HY, et al. Protective effect of folic acid on oxidative DNA damage: a randomized, double-blind, and placebo controlled clinical trial[J]. Medicine, 2015, 94(45): e1872. DOI:10.1097/MD.0000000000001872 |
| [8] | 卫生部. WS/T 211-2001地方性砷中毒诊断标准[S]. 北京: 中国标准出版社, 2004. |
| [9] | Haque R, Samanta S, Ghosh N, et al. Arsenic in drinking water and skin lesions: dose-response data from West Bengal, India[J]. Epidemiology, 2003, 14(2): 174–182. |
| [10] | Su L, Cheng Y, Lin S, et al. Study of relationship between arsenic methylation and skin lesion in a population with long-term high arsenic exposure[J]. Journal of Hygiene Research, 2007, 36(3): 336–340. |
| [11] | Engström K, Vahter M, Mlakar SJ, et al. Polymorphisms in arsenic(+III oxidation state) methyltransferase (AS3MT) predict gene expression of AS3MT as well as arsenic metabolism[J]. Environmental Health Perspectives, 2011, 119(2): 182–188. DOI:10.1289/ehp.1002471 |
| [12] | 张强, 郑全美, 席淑华, 等. 高砷暴露致皮肤损伤人群尿砷代谢产物分析[J]. 环境与健康杂志, 2009, 26(12): 1048–1050. |
| [13] | Wei B, Yu J, Li H, et al. Effects of arsenic methylation and metabolism on the changes of arsenic-related skin lesions[J]. Environmental Science and Pollution Research International, 2018, 25(7): 1–9. |
| [14] | Ren XF, Aleshin M, Jo WJ, et al. Involvement of N-6 adenine-specific DNA methyltransferase 1 (N6AMT1) in arsenic biomethylation and its role in arsenic-induced toxicity[J]. Environ. Health Perspect, 2011, 119(6): 771–777. DOI:10.1289/ehp.1002733 |
| [15] | Harari F, Engström K, Concha G, et al. N-6-adenine-specific DNA methyltransferase 1 (N6AMT1) polymorphisms and arsenic methylation in Andean women[J]. Environmental Health Perspectives, 2013, 121(7): 797–803. DOI:10.1289/ehp.1206003 |
| [16] | Zhang H, Ge YC, He P, et al. Interactive effects of N6AMT1 and As3MT in arsenic biomethylation[J]. Toxicol Sci, 2015, 146(2): 354–362. DOI:10.1093/toxsci/kfv101 |
| [17] | Chen XS, Guo XJ, He P, et al. Interactive influence of N6AMT1 and As3MT genetic variations on arsenic metabolism in the population of Inner Mongolia, China[J]. Toxicol Sci, 2017, 155(1): 124–134. DOI:10.1093/toxsci/kfw181 |
| [18] | Bahl C, Sharma S, Singh N, et al. Association study between genetic variations in Axin2 gene and lung cancer risk in North Indian population: a multiple interaction analysis[J]. Tumor Biol, 2017, 39(4): 18. |
| [19] | Su YS, Ding WH, Xing MJ, et al. The Interaction of TXNIP and AFq1 genes increases the susceptibility of schizophrenia[J]. Molecular Neurobiology, 2017, 54(6): 4806–4812. DOI:10.1007/s12035-016-9954-7 |