姜黄素是从姜科植物中提取的一种小分子量的酚类化合物。姜黄素具有抗氧化、抗炎、调控细胞生长和细胞分化以及安全等特性，临床上用于预防和治疗某些慢性疾病^{[1 – 2]}。研究表明姜黄素对糖尿病、癌症、自身免疫，心血管，神经和心理疾病均有治疗作用^{[3 – 4]}。尽管姜黄素有明显的效果，但由于其溶解度差，代谢迅速以及全身消除快，使姜黄素应用受到限制^[5]。因此，提高姜黄素的生物利用度成为研究热点。本研究采用H8（以姜黄素为母体结构合成的比姜黄素结构更稳定的姜黄素类似物 ^{[6 – 7]}）灌胃db/db小鼠（糖尿病模型），探讨H8对小鼠内脏脂肪代谢的影响及作用机制，旨在为开发治疗糖尿病新药物提供技术支撑。结果报告如下。

H8由牡丹江医学院（黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室）设计合成，其化学名称为（2E，5E）-2，5-双亚苄基环戊酮，高效液相色谱法检测纯度为99.3 %；罗格列酮（成都恒瑞制药有限公司）；羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）（哈尔滨化工化学试剂厂）；抗F4/80、脂代谢合成酶（fatty acid synthetase，FAS）、乙酰辅酶A羧化酶1（acetyl coenzyme a carboxylase 1，ACC1）、固醇调节元件绑定蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠、山羊抗兔抗体（美国Abcam公司），β-actin（美国Cell Signaling公司）；SYBR Green（美国Origene公司）；RNA逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）。台式高速离心机（德国SIGMA公司）；微型激光共聚焦显微镜（日本奥利巴斯公司）；荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）；自动化学发光凝胶成像分析系统（美国General Electric公司）。

8周龄SPF级db/db小鼠32只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012 – 0001，体重（23.5 ± 1.5）g。饲养条件：温度18～24 ℃，湿度50 %～70 %，12 h交替照明，自由进食进水。小鼠适应性喂养1周，随机分为4组，每组8只，分别为模型组、阳性对照组（罗格列酮5 mg/kg），H8低、高剂量组（H8 5、10 mg/kg），每天灌胃1次，连续8周，H8用1 %的CMC-Na溶液溶解，模型组小鼠给予1 % CMC-Na溶液灌胃，每周检测1次血糖、体重，观察小鼠状态。末次给药后，禁食12 h，不禁水，称量小鼠体重，麻醉，眼眦静脉取血，收集血液于离心管，于37 ℃孵育30 min，3 000 g离心15 min，吸取血清待测；取内脏脂肪称重并冻存于超低温冰箱备用。

使用自动生化分析仪检测脂蛋白a[lipoprotein a，LP（A）]、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、血糖水平。

采用苏木素 – 伊红 （hematoxylin eosin，HE） 染色法观察脂肪组织病理变化，将石蜡包埋的小鼠内脏脂肪组织在切片机上切片，厚度为4 μm；通过固定、脱水，HE染色，中性树脂封片，显微镜下观察各组小鼠内脏脂肪组织中脂肪细胞病理变化。

采用免疫荧光法，将石蜡切片脱蜡，水化，抗原修复，封闭，加1 : 50稀释的F4/80抗体孵育过夜，1 : 1 000的二抗孵育1 h，中性树脂封片，用激光共聚焦显微镜对组织切片进行拍照，采用数据分析软件进行绿色荧光蛋白光密度分析。

表 1

表 1 脂肪合成相关基因mRNA引物序列 基因 上游引物（5′ – 3′） 下游引物（5′ – 3′） 片段长度（bp） FAS NM_007988.3 GTTGGCCCAGAACTCCTGTA GTCGTCTGCCTCCAGAGC 110 ACC1 NM_133360.2 GGAGATGTACGCTGACCGAGAA ACCCGACGCATGGTTTTCA 105 SREBP NM_011480.4 TGGTTGTTGATGAGCTGGAG GGCTCTGGAACAGACACTGG 90 RPS16 NM_013647.2 CGTGCTTGTGCTCGGAGCTA GCTCCTTGCCCAGAAGCAAA 203

表 1 脂肪合成相关基因mRNA引物序列

采用荧光定量PCR方法，使用RNA提取试剂盒提取小鼠内脏脂肪组织总RNA，逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，取稀释好的cDNA 2 μL，加SYBR Green Mix 9 μL，FAS、ACC1、SREBP上下游引物各0.8 μL、内参（ribosomal protein S16，RPS16），ddH₂O 7.4 μL，荧光定量PCR仪反应条件如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；53～60 ℃退火30 s；扩增40个循环，每份标本做2个平行样，测出基因和内参的Ct值，按照标准曲线，计算相对表达量。

采取Western blot法，取小鼠脂肪组织提取蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，转膜45 min，封闭1 h，1:1 000稀释的一抗孵育（FAS、ACC1、SREBP、β-actin）过夜，1:10 000稀释的二抗孵育1 h，显色液显色后用自动化学发光凝胶成像分析仪照相，数据分析软件分析蛋白表达量。

实验数据用 $\bar x$ ± s表示，采用Graph Pad Prism 5.0软件进行统计分析，多组比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

表 2

表 2 H8对db/db小鼠内脏脂肪重量影响（ $\bar x$ ± s，n = 8） 组别 体重（g） 脂肪重量（g） 脂肪系数 模型组 59.75 ± 1.567 3.23 ± 0.22 5.7 ± 0.20 罗格列酮组 49.01 ± 2.858a 2.63 ± 0.15a 3.96 ± 0.24a H8 低剂量组 48.89 ± 3.766a 1.55 ± 0.2b 3.20 ± 0.23b H8 高剂量组 46.87 ± 2.024a 1.38 ± 0.37b 2.93 ± 0.75b 　　注：与模型组比较，a P < 0.05，b P < 0.01。

表 2 H8对db/db小鼠内脏脂肪重量影响（ $\bar x$ ± s，n = 8）

与对照组比较，罗格列酮组与低、高剂量H8组小鼠体重与内脏脂肪重量、内脏脂肪系数明显降低（P < 0.05）；表明H8可明显减少小鼠内脏脂肪堆积。

表 3

表 3 H8对db/db小鼠血液生化指标影响（mg/dL， $\bar x$ ± s，n = 8） 组别 脂蛋白a 胆固醇 甘油三酯 HDL LDL 血糖 模型组 0.671 ± 0.06 169.2 ± 10.5 108.6 ± 7.71 113.2 ± 6.5 19.7 ± 1.2 443.3 ± 31.2 罗格列酮组 0.621 ± 0.03 99.4 ± 1.3 b 74.5 ± 2.21 b 88.8 ± 2.7 10.7 ± 0.2 b 169.4 ± 13.2 b H8低剂量组 0.430 ± 0.02 a 132.5 ± 6.2 81.3 ± 4.1 a 123.6 ± 3.4 c 14.2 ± 0.7 b 230.1 ± 18.6 b H8高剂量组 0.300 ± 0.04 bc 130.1 ± 9.6 77.4 ± 3.5 b 134.1 ± 7.4 ac 13.4 ± 1.2 b 194.3 ± 21.4 b 　　注：与模型组比较，a P < 0.05，b P < 0.01；与罗格列酮组比较，c P < 0.01。

表 3 H8对db/db小鼠血液生化指标影响（mg/dL， $\bar x$ ± s，n = 8）

与模型组比较，罗格列酮组小鼠血清中胆固醇、甘油三酯、LDL和血糖水平明显降低（P < 0.01），低、高剂量H8组小鼠血清中脂蛋白a、甘油三酯、LDL和血糖水平明显降低（ P < 0.05）。

图 1

注：A模型组；B罗格列酮组；C、D H8低、高剂量组。 图 1 H8对db/db小鼠内脏脂肪细胞体积影响（HE，× 100）

模型组小鼠脂肪细胞体积为（801.2 ± 44.0）；罗格列酮组小鼠脂肪细胞体积为（729.3 ± 64.5）；低、高剂量H8组小鼠脂肪细胞体积分别为（304.7 ± 24.8）和（331.3 ± 18.0）；与模型组比较，罗格列酮组和低、高剂量H8组小鼠内脏脂肪细胞体积均明显减小（P < 0.01）。

图 2

注：A模型组；B罗格列酮组；C、D H8低、高剂量组。 图 2 H8对db/db小鼠脂肪组织F4/80蛋白表达影响（免疫荧光，× 100）

模型组、罗格列酮组、低、高剂量H8组小鼠内脏脂肪组织中F4/80表达量（光密度）分别为（1.0 ± 0.0）、（0.79 ± 0.03）、（0.39 ± 0.06）和（0.43 ± 0.04）；与模型组比较，罗格列酮组和低、高剂量H8组小鼠内脏脂肪组织中F4/80蛋白表达明显降低（P < 0.01）。

表 4

表 4 H8对db/db小鼠脂肪组织中脂肪合成相关基因表达影响（ $\bar x$ ± s，n = 8） 组别 FAS ACC1 SREBP 模型组 511.0 ± 32.5 78.1 ± 19.0 25.6 ± 3.9 罗格列酮组 204.9 ± 35.3 b 57.6 ± 25.7 a 15.1 ± 3.2 a H8低剂量组 217.0 ± 46.5 b 54.9 ± 5.4 b 14.2 ± 1.7 b H8高剂量组 249.1 ± 31.4 b 50.4 ± 5.3 b 13.4 ± 1.5 b 　　注：与模型组比较，a P < 0.05，b P < 0.01。

表 4 H8对db/db小鼠脂肪组织中脂肪合成相关基因表达影响（ $\bar x$ ± s，n = 8）

与模型组比较，罗格列酮组、低、高剂量H8组小鼠内脏脂肪组织中FAS、ACC1、SREBP的mRNA表达明显降低（P < 0.05）。

图 3

注：1 模型组；2 罗格列酮组；3、4低、高剂量H8组。 图 3 H8对db/db小鼠脂肪组织中脂肪合成相关蛋白表达影响

表 5

表 5 H8对db/db小鼠脂肪组织中脂肪合成相关蛋白表达影响（ $\bar x$ ± s，n = 8） 组别 FAS ACC1 SREBP 模型组 1.08 ± 0.08 0.34 ± 0.05 1.24 ± 0.13 罗格列酮组 0.71 ± 0.01 a 0.18 ± 0.03 a 0.82. ± 0.08 a H8低剂量组 0.69 ± 0.03 b 0.11 ± 0.02 b 0.36 ± 0.05 b H8高剂量组 0.41 ± 0.06 b 0.07 ± 0.01 b 0.41 ± 0.06 b 　　注：与模型组比较，a P < 0.05，b P < 0.01。

表 5 H8对db/db小鼠脂肪组织中脂肪合成相关蛋白表达影响（ $\bar x$ ± s，n = 8）

与模型组比较，罗格列酮组、低、高剂量H8组小鼠内脏脂肪组织中FAS、ACC1、SREBP蛋白表达显著降低（P < 0.05）。

临床上2型糖尿病是常见的慢性疾病，常伴随多种并发症^[8]。目前中药治疗2型糖尿病成为国内外研究热点。本研究结果显示，与模型组比较，各剂量H8组小鼠脂肪系数下降、脂蛋白a、胆固醇、甘油三酯、LDL、血糖水平明显降低，而HDL升高。提示，姜黄素类似物H8对2型糖尿病小鼠具有明显的降糖和降血脂作用。研究显示，内脏脂肪组织炎症的主要参与者是巨噬细胞，可导致肥胖症慢性低度炎症^[9]，而F4/80是脂肪组织巨噬细胞特异性标记蛋白^[10]。本研究结果显示，模型组小鼠脂肪组织变性，脂肪细胞肥大；与模型组比较，各剂量H8组小鼠脂肪细胞体积缩小，脂肪组织中F4/80蛋白表达明显降低。提示，H8对脂代谢具有改善作用。

FAS、ACC1、SREBP是参与脂肪合成的关键酶^[11]。FAS是机体内脂肪合成、堆积的最关键酶之一。当机体FAS含量升高时，催化丙二酰CoA成脂肪酸，机体内过多的脂肪酸能够通过酯化作用形成脂肪，导致机体内的脂肪沉积^[12]。ACC是机体内脂肪酸合成的限速酶之一，存在于脂肪细胞和肝脏细胞中，通过催化乙酰CoA生成丙二酰辅酶CoA，而后者是脂肪酸合成的主要底物，目前已知的ACC分为两类，ACC1和ACC2^[13]。SREBP是调节机体内脂肪合成代谢的最关键转录因子之一，受到胆固醇、营养因子、激素的共同调控，目前发现的SREBP有3种亚型：SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2。SREBP-1c主要调节机体内葡萄糖转化生成脂肪酸的初始合成途径，通过激活下游靶基因，促进甘油三酯和脂肪酸合成中多个限速酶的表达^[14]。本研究结果显示，与模型组比较，各剂量H8组小鼠脂肪组织中FAS、ACC1、SREBP基因和蛋白表达均明显降低。提示，姜黄素类似物H8对2型糖尿病小鼠具有明显的降血糖和调节血脂代谢作用，其机制可能与H8抑制脂肪组织中脂肪合成相关基因FAS、ACC1和SREBP表达有关。