2. 青海大学附属医院青海省包虫病重点实验室
囊型包虫病是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)的幼虫引起的一种慢性的、世界性和危害严重的人畜共患寄生虫病。棘球蚴病的治疗目前仍然面临很多困难,因为手术不能满足所有患者的需要,而药物治疗可能导致严重的不良事件和耐药[1]。为了应对当前的挑战,迫切需要筛选与新的抗包虫病药物相互作用的靶蛋白质。包虫病的快速诊断和高效低毒抗包虫病药物的筛选防治包虫病的2个研究方向。目前包虫病免疫学诊断所用的抗原是通过粗提原头节、囊液蛋白而获得,虽具有较高的敏感性和特异性[2 – 3],但抗原成分复杂,不适用于大规模生产,限制了其在临床上的运用。目前,利用生物信息学技术对筛选抗原进行生物学性质,抗原表位等进行预测,可提高特异性抗原筛选的效率[4]。本研究正是在这样的基础上借助生物信息学方法对磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TPI)进行抗原表位的分析预测,以期对此酶后续的研究起到指导作用。
1 材料与方法 1.1 EgTPI序列查询GenBank并经blast比对得到EgTPI氨基酸序列(No. :EUB56511.1)。
1.2 预测理化性质利用Expasy系统的protparam数据库(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)推测EgTPI理化性质。
1.3 预测二、三级结构使用Jpred4软件:(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/)和SWISS- MODEL(http:// swissmodel. expasy.org/)预测EgTPI分子的二级和三级结构。
1.4 B/T细胞表位预测利用ABCpred在线软件(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)及IEDB软件(http://tools.immuneepitope.org/main/html/tcell_tools.html)预测细粒棘球绦虫TPI抗原B细胞表位,选取2种方法预测中可能形成B细胞表位的相同部分。利用AMPHI法预测T细胞抗原表位、Rothbard-Taylor法对含特定基序T淋巴细胞抗原表位进行预测,结合2种推测方法结果分析优势性T细胞表位。
1.5 亚细胞定位预测使用PSORT II Prediction(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)程序。
1.6 氨基酸序列保守性分析通过GeneBank下载多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,CDS36936.1)、小口膜壳绦虫(Hymenolepis microstoma,CDS29962.1)、刺猬绦虫(Spirometra erinaceieuropaei,AFX72997.1)、肝片吸虫(Fasciola hepatica,AGJ83762.1)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum,U57557.1)、人类(Homo sapiens,AAB51316.1)TPI序列,使用MEGA 4.0软件进行多序列比对,分析TPI的保守性。
2 结 果 2.1 EgTPI基因与基氨基酸序列(图1)基因序列长978 bp,包括5个外显子和4个内含子,共编码250个氨基酸。
2.2 理化性质的预测结果EgTPI相对分子质量为27.12 kDa,等电点pI为6.60,半衰期为30 h,不稳定指数为22.14,EgTPI为稳定蛋白。
2.3 亚细胞定位预测PSORT II程序预测结果显示EgTPI位于细胞质。
2.4 B细胞表位预测借助ABCpred和IEDB软件分别对B细胞表位进行预测,然后分析2种方法预测可能形成的共同B细胞线性表位共6个氨基酸序列,分别是:28-39、50-60、70-80、131-139、150-159、213-231。
2.5 T细胞表位预测(图2)DNA star软件AMPHI和Rothbard-Taylor2种算法得到可能的T细胞表位为:16-30、71-85、98-119、142-154、178-2 005个区域。
2.6 二、三级结构预测结果(图3、4)Jpred 4在线软件预测的EgTPI的二级结构中直链结构占15.6 %、α 螺旋占38.9 %、转角结构占12.0 %、其他结构占42.2 %,具体包括1个 β 折叠(beta sheet)、7个 β-α-β 基序(beta-alpha-beta motifs)、8个直链(strand)、14个螺旋(helix)、19个螺旋-螺旋交互结构(helix-helix interaction)、13个 β 转角(beta turn)、3个 γ 转角(gamma turn)结构,SWISS-MODEL网站预测的EgTPI的三级结构。
2.7 多序列比对结果(图5)经MEGA 4.0软件比对结构显示,所有序列平均一致度为68.25 %,经比对所有序列中共有234个变异位点 (variable sites) 、64简约性信息位点 (parsimony-informative site) 、168单态突变位点 (singleton variable)。人类TPI与细粒棘球绦虫TPI一致度仅为40.08 %,较大的差异更有利于形成抗原表位,同时也可为设计药物靶点提供基础。
3 讨 论磷酸丙糖异构酶(TPI)在糖酵解中有重要作用,而血吸虫磷酸丙糖异构酶对于血吸虫感染具有显著的免疫保护作用,发现重组TPI蛋白具有较好的抗损伤和感染能力[5]。研究者对猪带绦虫TPI[6]和弓形虫TPI[7]分别进行了克隆表达和免疫保护性研究,发现TPI可激活实验动物免疫反应具有一定的免疫保护作用。还有研究发现奥美拉唑能够通过灭活贾第鞭毛虫的磷酸丙糖异构酶活性达到抑制贾第鞭毛虫滋养体生长的作用[8]。TPI在蠕虫和原虫中都有一定的保护作用,但是TPI在棘球绦虫中的研究还未见报道。
本研究通过理化特性预测发现TPI为一种稳定存在的蛋白质,半衰期较长,寄生虫疫苗研制的一个难点就是由于大多数寄生虫要经历数个生长阶段,各个阶段差异较大,很难找到在各个阶段都能稳定表达且能引起机体强烈免疫反应的分子,而由于需要从宿主摄取营养,与代谢有关的酶类分子通常需要各个生活史阶段都需要表达,因此稳定的分子更有可能成为疫苗设计的靶点。
通过Jpred 4在线软件预测EgTPI二级结构中直链结构占15.6 %、α 螺旋占38.9 %、转角结构占12.00 %,认为 β 转角、无规则卷曲结构疏散有利于形成B细胞抗原表位,而 α 螺旋结构不易变形,通常不作为抗原表位[9]。EgTPI二级结构中转角结构包括13个 β 转角、3个 γ 转角结构,这些区域有望形成抗原表位。从EgTPI的三级空间结构发现有较多的无规则卷曲,无规则卷曲结构疏松,利于与抗体分子结合,这也为形成B细胞线性表位提供了可能。
综上所述,通过各种在线软件预测EgTPI理化性质,T、B细胞表位,得到6个可能形成B细胞表位的区域、5个优势T细胞表位区域,提示EgTPI基因有可能成为免疫诊断和药物治疗的靶点,本研究也将为后续EgTPI的研究提供实验基础。
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