中国公共卫生  2019, Vol. 35 Issue (2): 176-179   PDF    
镧对仔鼠大脑海马星形胶质细胞兴奋性影响
刘诗语, 尼加提.帕尔合提, 王璟, 卢言新, 黄丽玲, 蔡原    
中国医科大学公共卫生学院卫生毒理教研室,辽宁 沈阳 110013
摘要目的 观察氯化镧(LaCl3)对星形胶质细胞兴奋性的影响,探讨其神经毒作用机制。方法 雌性Wistar大鼠40只,随机分为5组,对照组饮用蒸馏水,染镧组分别饮用含有不同浓度氯化镧(0.125 %、0.250 %、0.500 %和1.000 %)的蒸馏水溶液,从雌鼠妊娠起到仔鼠断乳后1个月结束。采用Fura-2荧光探针法检测仔鼠大脑海马神经细胞内Ca2+浓度;酶联免疫分析(ELISA)法测定1,4,5 – 三磷酸肌醇(IP 3)含量;实时定量PCR法测定促代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)、磷脂酶C(PLC)和缝隙连接蛋白(Cx43)mRNA转录水平;Western blot法测定mGluR5、PLC和Cx43蛋白表达水平。结果 与对照组比较,随氯化镧染毒剂量增加,染镧组仔鼠海马神经细胞内Ca2+浓度与IP3含量趋势性升高,呈剂量效应关系(P < 0.05);与对照组比较,各剂量染镧组大鼠仔鼠海马神经元内mGluR5、PLC和Cx43 mRNA表达上调,mGluR5、PLC和Cx43蛋白表达水平显著上调,呈剂量效应关系( P < 0.05)。结论 氯化镧可致大鼠仔鼠脑海马星形胶质细胞过度兴奋,诱发兴奋性毒性,进而造成神经元损伤。
关键词     学习记忆     Ca2+     1,4,5 – 三磷酸肌醇(IP 3     缝隙连接蛋白(Cx43)    
Effect of lanthanum on excitability of hippocampus astrocytes in offspring rats
LIU Shi-yu, Nijiati·Parerheti, WANG Jing, et al     
Department of Hygiene and Toxicology, School of Public Health, China Medical University, Shenyang, Liaoning Province 110122, China
Abstract: Objective To observe the effect of lanthanum chloride (LaCl3) on excitability of hippocampus astrocytes and to explore the mechanism of the neurotoxic effect. Methods Forty female Wistar rats were randomly divided into 5 groups; the rats of the 4 experimental groups were supplied with distilled drinking water containing LaCl3 at various concentration (0.125%, 0.250%, 0.500%, and 1.000%) and those of the control group with uncontaminated distilled water during the period from pregnancy till the end of first weaning month. Intracellular bivalent calcium ion (Ca2+) concentration in hippocampal neurons of the offspring rats was detected with Fura-2 fluorescent probe method and the inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) content was determined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The mRNA transcription of metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5), phospholipase C (PLC), and connexin (Cx43) were determined with real-time quantitative PCR; the protein expression of mGluR5, PLC, and Cx43 were detected with Western blot. Results Compared with those of the control rats, the Ca2+ concentration and IP3 content in hippocampal neurons of the experimental rats increased with the increment of LaCl3 in a dose-effect manner (both P < 0.05); while, the expressions of mGluR5, PLC, and Cx43 mRNA and protein in hippocampal neurons of experimental rats were all up-regulated with the increment of LaCl 3 in a dose-effect manner (P < 0.05 for all). Conclusion Lanthanum chloride can cause excessive excitability of hippocampal astrocytes and induce neuronal damage in offspring rats with maternal Lanthanum chloride exposure.
Key words: lanthanum     learning and memory     bivalent calcium ion     inositol 1,4,5-trisphosphate     gap junction protein (Cx43)    

镧(lanthanum,La)属于轻稀土元素,应用广泛,在环境介质与食品中含量较高,能够透过血脑屏障在脑中蓄积,诱发中枢神经系统毒性作用,但相关机制尚未完全阐明。近年来研究表明,星形胶质细胞(astrocyte,AC)可发生以胞内Ca2+升高和细胞间“钙波”形成为标志的化学性兴奋,诱发多种胶质递质的合成与释放,作用于突触后膜的N – 甲基 – D – 天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体,发挥调控突触可塑性和神经元兴奋性的生理作用。但当AC过度兴奋时,会合成、释放过量的谷氨酸、D-丝氨酸等兴奋性递质到突触间隙,导致NMDA受体的过度活化和兴奋性毒性,造成神经元损伤 [1]。本研究采用整体动物试验,观察出生前后氯化镧(lanthanum chloride,LaCl3)染毒对子代大鼠大脑海马AC兴奋性相关指标的影响,为揭示其神经毒作用机制提供依据。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

LaC13(分析纯,国药沈阳化学试剂有限公司),Fura-2/AM(日本同仁化学研究所),牛血清白蛋白(上海丽珠东风生物技术有限公司),大鼠1,4,5 – 三磷酸肌醇( inositol 1,4,5-trisphosphate,IP 3)酶联免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、兔抗大鼠代谢性谷氨酸受体5亚型(metabotropic glutamate receptor subtype 5,mGluR5)一抗(英国Abcam公司),兔抗大鼠磷脂酶C(phospholipase C,PLC)一抗、兔抗大鼠甘油醛 – 3 – 磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗(美国Santa Cruz公司),兔抗大鼠缝隙连接蛋白(Cx43)一抗(美国CST公司),HRP标记的山羊抗兔二抗(北京中杉金桥公司)。CS15OGXL型低温高速离心机(日本日立公司),DYY-6B型垂直电泳仪(北京六一仪器厂),AE-6685 powered BLOT mini电转移泳槽(日本ATTO公司),13395H2X型生物显微镜(上海徕卡显微系统有限公司),ABI PRISM7900HI Real time PCR仪(美国Applied Bio Systems公司 ),F-4500型荧光双波长分光光度计(日本日立公司)。

1.2 动物分组与染毒

SPF级Wistar大鼠由中国医科大学实验动物中心提供,许可证号:SYXK(辽): 2013 – 0007,共60只,体重250~270 g,雌雄比例2 ∶ 1。正式实验前饲养7 d,实验动物室温度20~23 ℃,相应湿度45 %~55 %,动物饲料由实验动物中心提供。将40只雌性大鼠随机分为对照组(饮用蒸馏水)、0.125 %、0.250 %、0.500 %和1.000 % LaCl 3染毒组(分别饮用含有相应浓度LaCl3的蒸馏水),每组8只,按雌、雄动物2 ∶ 1进行同笼交配,次日晨发现阴栓或阴道分泌物镜检有精子者定为受孕,记为妊娠第0天,并开始染镧。染镧组仔鼠在断乳前经由母体血循环和吸吮母乳染镧,断乳后则通过自行饮水染镧,至断乳后1个月结束,进行各项指标测定。

1.3 指标与方法 1.3.1 仔鼠大脑海马神经元内[Ca2+]i含量测定

大鼠经乙醚麻醉后断头,取海马,用冰冷磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗2~3次,弃上清,剪碎,加入0.25 %胰酶2 mL,37 ℃恒温水浴25 min,轻轻吹打,加入冰冷的含10 %小牛血清(v/v)的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle medium) 3 mL终止消化,200目筛网过滤;以800 r/min低温离心滤液5 min,弃上清,PBS重悬,经台盼蓝排斥实验,细胞存活率达到95 %以上,调整细胞浓度至1 × 106个/mL。剩余细胞悬液中加入Fura-2/AM 5 μL(终浓度为2.5 μmol/L),避光,37 ℃震荡水浴45 min,800 r/min低温离心5 min,弃上清,用PBS定容至1 mL。采用荧光双波长分光光度计测定Ca2+荧光强度。测定条件:激发光光栅5 nm,发射光光栅10 nm,37 ℃,避光;以激发波长340 nm和380 nm,发射波长510 nm扫描。取细胞悬液400 μL,加入10 % Triton X-100,测定最大荧光比值(R max),待曲线稳定后加入0.3 % EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid),测定最小荧光比值(R min)。由系统定量软件自动求出Ca2+含量。

1.3.2 仔鼠脑海马神经细胞内IP3测定

冰浴上快速取大脑海马组织,加PBS(pH 7.4)匀浆,2 000 r/min离心20 min,留上清。在酶标包被板上设空白孔和待测样品孔,待测样品孔中先加入样品稀释液40 μL,然后再加待测样品10 μL,轻晃混匀。用封板膜封板后置37 ℃温浴30 min;甩干,加洗涤液,静置30 s后弃去,重复5次,拍干;每孔加入酶标试剂50 μL,用封板膜封板后,重复上述操作1次每孔先后加入显色剂A、B各50 μL,震荡混匀,37 ℃避光显色15 min;加终止液50 μL,终止反应。空白孔除不加样品及酶标试剂外,其余步骤与待测样品孔相同。以空白孔调零,450 nm波长依序测定各孔的吸光度(A)值。

1.3.3 仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43 mRNA水平测定(表1
表 1 基因引物序列

取海马组织样品,按照说明书提取总RNA,反转录合成稳定的cDNA(在50 μL cDNA反应液内加入10 μmol/L的特异引物,按照说明书,对模板采用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)法进行相对定量分析。产物特异时,平均溶解温度一致,溶解曲线无杂峰。

1.3.4 仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43蛋白水平测定

取大脑海马组织,加入预冷的裂解液,超声粉碎制成匀浆,4 ℃,12 000 r/min离心30 min,所得上清即为总蛋白。采用Bradford法测定蛋白含量,把样品调成相同浓度,在10 % SDS(sodium dodecyl sulfate)-聚丙烯酰胺电泳中分离蛋白。之后将蛋白条带转移至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上,5 %脱脂奶粉封闭2 h,PBST(phosphate buffered saline with Tween-20)洗3次,分别加入兔抗大鼠mGluR5、PLC、Cx43(1 : 1 000)一抗在4 ℃孵育过夜,以PBST洗膜后加羊抗兔IgG(二抗,1 : 3 000) 于室温下孵育2 h,PBST再次洗膜后增强化学发光法显影。采用Sion Image软件分析,记录每条蛋白电泳带的灰度值,进行定量分析。

1.4 统计分析

实验数据以 $\bar x \pm s$ 表示,采用SPSS 17.0软件进行统计分析。应用单因素方差分析方法(one-way analysis of variance)进行组间差异的显著性检验,当组间差异具有统计学意义时,采用q检验(Student Newman Keuls)进行两组间比较;相关性采用Spearman相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 染镧对仔鼠大脑海马神经细胞[Ca2+]i和IP3含量影响(表2
表 2 染镧对仔鼠大脑海马神经细胞[Ca2+]i和IP3含量影响( $\bar x \pm s$ n = 8)

与对照组比较,随着染镧剂量增加,染镧组仔鼠大脑海马神经细胞[Ca2+]i、IP3含量明显升高,呈剂量效应关系(P < 0.05)。

2.2 染镧对仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43 mRNA表达影响(表3
表 3 染镧对仔鼠海马神经细胞关键基因mRNA表达影响( $\bar x \pm s$ n = 8)

与对照组比较,随着染镧剂量增加,染镧组仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43 mRNA表达上调,呈剂量效应关系(P < 0.05)。

2.3 染镧对仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43蛋白表达影响(图1表4
注:1 对照组;2~5 0.125 %、0.250 %、0.500 %、1.000 % LaCl3组。 图 1 染镧对仔鼠海马神经细胞内关键蛋白表达影响

表 4 镧对仔鼠海马神经细胞内关键蛋白表达的影响( $\bar x \pm s$ n = 8)

与对照组比较,随着染镧剂量增加,染镧组仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43 蛋白表达明显上调,呈剂量效应关系(P < 0.05)。

3 讨 论

研究表明La可以在大脑皮质和海马蓄积,引起神经细胞凋亡和学习记忆障碍[2],但机制尚不十分清楚。AC曾被认为是一种“惰性”细胞,仅对神经元具有支撑和营养作用。但近年来研究发现,AC不仅具有以胞内Ca2+升高为标志的兴奋性,而且还是三重突触(tripartite synapse)的组成成分,其合成、释放的胶质递质如谷氨酸、D - 丝氨酸等参与调节突触可塑性并改变神经元的兴奋状态[3]。其中,谷氨酸可作用于突触后膜的N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR),使突触后神经元兴奋并使突触传递效能增强[45];D - 丝氨酸作为NMDAR的共激动剂,可与其功能亚单位NR1上的甘氨酸位点结合,协同增强Glu对NMDAR的激动作用[6]。二者对于维持学习记忆功能均具有重要作用。但在病理状态下,过量释放的谷氨酸和D - 丝氨酸可导致NMDAR的过度激活,诱发兴奋性毒性,引起神经元的损伤和死亡[6]

促代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)属于G蛋白偶联受体超级家族的C类成员,主要定位于AC膜上,可被突触前膜释放的兴奋性递质谷氨酸激活而成为AC兴奋的起点[7]。磷脂酶C(PLC)是磷脂酰肌醇信号通路的关键酶,活化的mGluR5可通过G蛋白与其偶联[8]并将其激活,催化PIP2水解生成IP3。IP3可进一步与位于内质网、肌浆网等“钙库”的IP3受体结合使其活化,开放Ca2+通道,导致胞液内的Ca2+骤然升高,AC兴奋[9]。本研究结果显示,La染毒可明显上调仔鼠大脑海马神经细胞内mGluR5和PLC的基因转录和蛋白表达水平,显著增加IP3含量,并使胞内Ca2+含量异常升高。提示,La可以引起AC的过度兴奋。

单个AC的兴奋可通过缝隙连接(gap junction,GJ)传播至周围细胞,形成钙波,引起众多AC的同步兴奋,形成“功能性合胞体”(functional syncytium)对神经元活动作出协调一致的反应[10]。缝隙连接作为细胞膜上的一类特殊结构,是目前已知的唯一能在细胞间直接交换物质和信息的通道[11]。Cx43是构成AC的缝隙连接通道的主要蛋白[12],其表达水平可以反映相邻AC间通讯的程度。研究表明含有低水平Cx的C6神经胶质瘤细胞在受到机械刺激时,仅表现为胞内Ca2+水平升高,但该细胞转染Cx43后即可在邻近细胞中形成钙波[13]。提示,Cx43在缝隙连接细胞间通讯中具有重要作用。本研究结果显示,La可显著上调仔鼠海马神经细胞中Cx43的基因转录和蛋白表达水平。提示,La能够促进AC兴奋性的传播和钙波形成,诱发AC的过度兴奋。

综上所述,镧可能通过使AC过度兴奋,释放大量谷氨酸、D-丝氨酸等兴奋性递质诱发兴奋性毒性,进而导致神经元的损伤,最终影响学习记忆能力。

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