镧(lanthanum,La)属于轻稀土元素,应用广泛,在环境介质与食品中含量较高,能够透过血脑屏障在脑中蓄积,诱发中枢神经系统毒性作用,但相关机制尚未完全阐明。近年来研究表明,星形胶质细胞(astrocyte,AC)可发生以胞内Ca2+升高和细胞间“钙波”形成为标志的化学性兴奋,诱发多种胶质递质的合成与释放,作用于突触后膜的N – 甲基 – D – 天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体,发挥调控突触可塑性和神经元兴奋性的生理作用。但当AC过度兴奋时,会合成、释放过量的谷氨酸、D-丝氨酸等兴奋性递质到突触间隙,导致NMDA受体的过度活化和兴奋性毒性,造成神经元损伤 [1]。本研究采用整体动物试验,观察出生前后氯化镧(lanthanum chloride,LaCl3)染毒对子代大鼠大脑海马AC兴奋性相关指标的影响,为揭示其神经毒作用机制提供依据。结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器LaC13(分析纯,国药沈阳化学试剂有限公司),Fura-2/AM(日本同仁化学研究所),牛血清白蛋白(上海丽珠东风生物技术有限公司),大鼠1,4,5 – 三磷酸肌醇( inositol 1,4,5-trisphosphate,IP 3)酶联免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、兔抗大鼠代谢性谷氨酸受体5亚型(metabotropic glutamate receptor subtype 5,mGluR5)一抗(英国Abcam公司),兔抗大鼠磷脂酶C(phospholipase C,PLC)一抗、兔抗大鼠甘油醛 – 3 – 磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗(美国Santa Cruz公司),兔抗大鼠缝隙连接蛋白(Cx43)一抗(美国CST公司),HRP标记的山羊抗兔二抗(北京中杉金桥公司)。CS15OGXL型低温高速离心机(日本日立公司),DYY-6B型垂直电泳仪(北京六一仪器厂),AE-6685 powered BLOT mini电转移泳槽(日本ATTO公司),13395H2X型生物显微镜(上海徕卡显微系统有限公司),ABI PRISM7900HI Real time PCR仪(美国Applied Bio Systems公司 ),F-4500型荧光双波长分光光度计(日本日立公司)。
1.2 动物分组与染毒SPF级Wistar大鼠由中国医科大学实验动物中心提供,许可证号:SYXK(辽): 2013 – 0007,共60只,体重250~270 g,雌雄比例2 ∶ 1。正式实验前饲养7 d,实验动物室温度20~23 ℃,相应湿度45 %~55 %,动物饲料由实验动物中心提供。将40只雌性大鼠随机分为对照组(饮用蒸馏水)、0.125 %、0.250 %、0.500 %和1.000 % LaCl 3染毒组(分别饮用含有相应浓度LaCl3的蒸馏水),每组8只,按雌、雄动物2 ∶ 1进行同笼交配,次日晨发现阴栓或阴道分泌物镜检有精子者定为受孕,记为妊娠第0天,并开始染镧。染镧组仔鼠在断乳前经由母体血循环和吸吮母乳染镧,断乳后则通过自行饮水染镧,至断乳后1个月结束,进行各项指标测定。
1.3 指标与方法 1.3.1 仔鼠大脑海马神经元内[Ca2+]i含量测定大鼠经乙醚麻醉后断头,取海马,用冰冷磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗2~3次,弃上清,剪碎,加入0.25 %胰酶2 mL,37 ℃恒温水浴25 min,轻轻吹打,加入冰冷的含10 %小牛血清(v/v)的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle medium) 3 mL终止消化,200目筛网过滤;以800 r/min低温离心滤液5 min,弃上清,PBS重悬,经台盼蓝排斥实验,细胞存活率达到95 %以上,调整细胞浓度至1 × 106个/mL。剩余细胞悬液中加入Fura-2/AM 5 μL(终浓度为2.5 μmol/L),避光,37 ℃震荡水浴45 min,800 r/min低温离心5 min,弃上清,用PBS定容至1 mL。采用荧光双波长分光光度计测定Ca2+荧光强度。测定条件:激发光光栅5 nm,发射光光栅10 nm,37 ℃,避光;以激发波长340 nm和380 nm,发射波长510 nm扫描。取细胞悬液400 μL,加入10 % Triton X-100,测定最大荧光比值(R max),待曲线稳定后加入0.3 % EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid),测定最小荧光比值(R min)。由系统定量软件自动求出Ca2+含量。
1.3.2 仔鼠脑海马神经细胞内IP3测定冰浴上快速取大脑海马组织,加PBS(pH 7.4)匀浆,2 000 r/min离心20 min,留上清。在酶标包被板上设空白孔和待测样品孔,待测样品孔中先加入样品稀释液40 μL,然后再加待测样品10 μL,轻晃混匀。用封板膜封板后置37 ℃温浴30 min;甩干,加洗涤液,静置30 s后弃去,重复5次,拍干;每孔加入酶标试剂50 μL,用封板膜封板后,重复上述操作1次每孔先后加入显色剂A、B各50 μL,震荡混匀,37 ℃避光显色15 min;加终止液50 μL,终止反应。空白孔除不加样品及酶标试剂外,其余步骤与待测样品孔相同。以空白孔调零,450 nm波长依序测定各孔的吸光度(A)值。
1.3.3 仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43 mRNA水平测定(表1)取海马组织样品,按照说明书提取总RNA,反转录合成稳定的cDNA(在50 μL cDNA反应液内加入10 μmol/L的特异引物,按照说明书,对模板采用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)法进行相对定量分析。产物特异时,平均溶解温度一致,溶解曲线无杂峰。
1.3.4 仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43蛋白水平测定取大脑海马组织,加入预冷的裂解液,超声粉碎制成匀浆,4 ℃,12 000 r/min离心30 min,所得上清即为总蛋白。采用Bradford法测定蛋白含量,把样品调成相同浓度,在10 % SDS(sodium dodecyl sulfate)-聚丙烯酰胺电泳中分离蛋白。之后将蛋白条带转移至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上,5 %脱脂奶粉封闭2 h,PBST(phosphate buffered saline with Tween-20)洗3次,分别加入兔抗大鼠mGluR5、PLC、Cx43(1 : 1 000)一抗在4 ℃孵育过夜,以PBST洗膜后加羊抗兔IgG(二抗,1 : 3 000) 于室温下孵育2 h,PBST再次洗膜后增强化学发光法显影。采用Sion Image软件分析,记录每条蛋白电泳带的灰度值,进行定量分析。
1.4 统计分析实验数据以
与对照组比较,随着染镧剂量增加,染镧组仔鼠大脑海马神经细胞[Ca2+]i、IP3含量明显升高,呈剂量效应关系(P < 0.05)。
2.2 染镧对仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43 mRNA表达影响(表3)与对照组比较,随着染镧剂量增加,染镧组仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43 mRNA表达上调,呈剂量效应关系(P < 0.05)。
2.3 染镧对仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43蛋白表达影响(图1、表4)与对照组比较,随着染镧剂量增加,染镧组仔鼠大脑海马神经细胞mGluR5、PLC和Cx43 蛋白表达明显上调,呈剂量效应关系(P < 0.05)。
3 讨 论研究表明La可以在大脑皮质和海马蓄积,引起神经细胞凋亡和学习记忆障碍[2],但机制尚不十分清楚。AC曾被认为是一种“惰性”细胞,仅对神经元具有支撑和营养作用。但近年来研究发现,AC不仅具有以胞内Ca2+升高为标志的兴奋性,而且还是三重突触(tripartite synapse)的组成成分,其合成、释放的胶质递质如谷氨酸、D - 丝氨酸等参与调节突触可塑性并改变神经元的兴奋状态[3]。其中,谷氨酸可作用于突触后膜的N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR),使突触后神经元兴奋并使突触传递效能增强[4 – 5];D - 丝氨酸作为NMDAR的共激动剂,可与其功能亚单位NR1上的甘氨酸位点结合,协同增强Glu对NMDAR的激动作用[6]。二者对于维持学习记忆功能均具有重要作用。但在病理状态下,过量释放的谷氨酸和D - 丝氨酸可导致NMDAR的过度激活,诱发兴奋性毒性,引起神经元的损伤和死亡[6]。
促代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)属于G蛋白偶联受体超级家族的C类成员,主要定位于AC膜上,可被突触前膜释放的兴奋性递质谷氨酸激活而成为AC兴奋的起点[7]。磷脂酶C(PLC)是磷脂酰肌醇信号通路的关键酶,活化的mGluR5可通过G蛋白与其偶联[8]并将其激活,催化PIP2水解生成IP3。IP3可进一步与位于内质网、肌浆网等“钙库”的IP3受体结合使其活化,开放Ca2+通道,导致胞液内的Ca2+骤然升高,AC兴奋[9]。本研究结果显示,La染毒可明显上调仔鼠大脑海马神经细胞内mGluR5和PLC的基因转录和蛋白表达水平,显著增加IP3含量,并使胞内Ca2+含量异常升高。提示,La可以引起AC的过度兴奋。
单个AC的兴奋可通过缝隙连接(gap junction,GJ)传播至周围细胞,形成钙波,引起众多AC的同步兴奋,形成“功能性合胞体”(functional syncytium)对神经元活动作出协调一致的反应[10]。缝隙连接作为细胞膜上的一类特殊结构,是目前已知的唯一能在细胞间直接交换物质和信息的通道[11]。Cx43是构成AC的缝隙连接通道的主要蛋白[12],其表达水平可以反映相邻AC间通讯的程度。研究表明含有低水平Cx的C6神经胶质瘤细胞在受到机械刺激时,仅表现为胞内Ca2+水平升高,但该细胞转染Cx43后即可在邻近细胞中形成钙波[13]。提示,Cx43在缝隙连接细胞间通讯中具有重要作用。本研究结果显示,La可显著上调仔鼠海马神经细胞中Cx43的基因转录和蛋白表达水平。提示,La能够促进AC兴奋性的传播和钙波形成,诱发AC的过度兴奋。
综上所述,镧可能通过使AC过度兴奋,释放大量谷氨酸、D-丝氨酸等兴奋性递质诱发兴奋性毒性,进而导致神经元的损伤,最终影响学习记忆能力。
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