2. 青岛市黄岛区妇幼保健计划生育服务中心儿保科;
3. 山东省疾病预防控制中心免疫预防管理所;
4. 青岛市疾病预防控制中心环境卫生科;
5. 青岛市中心血站
多环芳烃类(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)作为一类环境致癌物质,胎儿期暴露能够引起神经发育毒性[1]。有研究显示,中国非职业暴露一般人群尿中PAHs代谢标志物1 – 羟基芘水平是其他国家和地区的4~10倍;城市家庭PAHs在居室室内灰尘中的浓度也远远高于其他国家和地区 [2]。居室内灰尘中PAHs水平与儿童智力发育和神经行为异常呈正相关,以引起强迫性、内向性行为问题为主[2]。外来化学物质在体内的代谢转化是影响其健康效应的重要因素。我们前期调查了参与PAHs解毒的谷胱甘肽 – S – 转移酶(glutathione S-transferase,GST)GSTM1、GSTM3和GSTT2基因多态性对儿童6月龄时智力发育的影响,发现GSTM3的rs7483位点多态性可能在6月龄时即可影响到幼儿的智力发育 [3]。本研究以青岛地区2014年建立的出生队列人群为研究对象,调查幼儿参与PAHs代谢的细胞色素P450(cytochrome P-450,CYP)家族的CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1酶基因多态性对幼儿36月龄时智力发育的影响。
1 对象与方法 1.1 对象以2014年1 — 12月青岛市黄岛区妇幼保健计划生育一中心、青岛市市北区人民医院、青岛市市立医院、青岛市第八人民医院、青岛市海慈医院共5家主要医院出生的儿童为研究对象,共募集到1 973名符合纳入标准的儿童,建立出生队列。纳入过程中重点排除了在分娩或新生儿期影响神经发育情况的产伤、低出生体质量、窒息、颅内出血、缺氧缺血性脑病等。考虑到很多先天和后天的营养性或遗传代谢性疾病可能导致神经发育异常,规定纳入的儿童需未患先天性生长发育不良或缺陷(尤其是智力缺陷),也没有临床确诊的甲状腺疾病或免疫缺陷等[4]。在队列人群中,简单随机抽取了850名资料齐全的儿童作为本次研究对象。该项研究已经过青岛市疾病预防控制中心伦理委员会批准,所有研究儿童的父母已知情并书面同意参与本次研究。
1.2 幼儿发育商的测定由专业的儿童保健科医生采用盖泽尔发展诊断量表(Gesell Development Diagnosis Scale)对幼儿的智力发育进行测试。测试内容包括适应性行为、大运动行为、精细动作、语言行为和个人社交五大功能区,测试结果以发育商(development quotient,DQ)表示[5]。每个功能区获得1个DQ分,分别表示各个功能区的发育情况。DQ得分越高,说明智力发育越高;临床一般以90分为界,≤ 90分为神经发育一般及低下,> 90分为神经发育正常及良好。其他具体描述见相关文献[3]。
1.3 代谢酶基因分型队列儿童出生时,用乙二胺四乙酸抗凝管采集5 mL脐带血,美国Promega公司试剂盒(A1125)提取脐带血全血基因组DNA。利用SNP500Cancer及1000genomes提供的关于CYP450的酶基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),筛选出针对中国人的CYP1A1(rs1048943、rs4646421、rs2606345、rs2472299、rs2198843、rs1456432、rs4646903)、CYP1A2(rs2069522、rs4646425、rs2069514、rs762551、rs2069526、rs4886406、rs2472304)、CYP1B1(rs162555、rs10568836、rs10175368、rs2567206、rs162560、rs2617266、rs10012、rs162549、rs162562、rs9341266)的SNPs(single nucleotide polymorphisms)。基因分型采用Sequenom MassArray系统,由北京六合华大基因科技有限公司负责完成[4]。
1.4 统计分析应用Epi Data 3.1录入数据,采用SPSS 21.0软件进行统计分析。Hardy-Weinberg行基因型分布平衡检验。Kolmogorov-Smirnov检验显示DQ得分近似正态分布。单因素方差分析比较不同基因型间DQs的差异,χ2检验或精确概率Fisher检验用于分类变量的相关分析。双侧检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 幼儿的基本情况本次调查的850名幼儿中,男性439人(51.65 %),女性411人(48.35 %);平均出生体重为(3.5 ± 1.20)kg,平均孕龄为(39.5 ± 1.30)周。母亲文化程度小学及以下20人,占2.35 %;初中260人,占30.59 %;高中或中专284人,占33.41 %;大专或本科275人,占32.35 %;硕士及以上10人,占1.18 %。父亲文化程度小学及以下12人,占1.41 %;初中232人,占27.29 %;高中或中专315人,占37.06 %;大专或本科281人,占33.06 %;硕士及以上10人,占1.18 %。家庭人均收入 < 2 000元64人,占7.53 %;2 000~5 000元599人,占70.47 %;> 5 000元186人,占21.88 %。家人居室内有吸烟者共264人,占31.06 %。
2.2 酶基因分型及幼儿神经发育情况Hardy-Weinberg遗传平衡检验显示,除rs2198843、rs2472299、rs2606345、rs2069514和rs10012外,其他SNPs均符合遗传平衡规律。不符合遗传平衡规律的SNPs基因型分布仍与美国国立生物技术信息中心的dbSNP数据库显示的比例相仿。适应性行为、大运动行为、精细运动行为、语言行为、个人社交行为五大功能分区的得分分别为(99 ± 7)、(102 ± 9)、(103 ± 9)、(96 ± 7)、(103 ± 8)分,男女童间DQs得分未见差异(P > 0.05)。
2.3 基因多态性对幼儿神经发育的影响(表1)单因素方差分析有统计学意义的目标基因型为CYP1A1(rs2606345、rs4646421)、CYP1A2(rs2069526、rs2472304)、CYP1B1(rs10012、rs2617266、rs9341266、rs10175368)。rs2606345的次要等位基因频率AA纯合子型大运动行为、精细运动行为和语言的DQs均高于CC纯合子和CA杂合子(P < 0.05)。rs4646421 的AA纯合子型的适应性行为DQs高于GG纯合子和AG杂合子,rs2472304的AA纯合子型精细动作行为DQs高于GG纯合子和GA杂合子,rs10012的CC纯合子型个人社交行为DQs高于GG纯合子和GC杂合子,rs2617266的AA纯合子型个人社会行为DQs高于GG纯合子与AG杂合子,rs9341266对应的AA纯合子型个人社会行为DQs高于GG纯合子与GA杂合子,rs10175368对应的TT纯合子型个人社会行为DQs高于CC纯合子和CT杂合子(均 P < 0.05)。具体见 表1。将DQs以90分两分类,χ2检验分析不同基因型与DQs的关联,结果发现不同基因型间DQs无统计学差异。进一步以P25值将DQs两分类,仍未发现SNPs基因型对不同DQs的风险,因此未进一步多元分析。
3 讨 论
本研究主要针对出生队列3岁龄儿童,分析幼儿PAHs代谢途径关键酶基因多态性对神经发育的影响。虽然无法进行多因素分析,但是单因素分析的结果显示,PAHs代谢途径部分关键酶基因多态性可能影响到3岁龄幼儿的神经发育。本次研究采用的盖泽尔发展诊断量表在中国的临床上应用广泛。该量表更倾向于代表儿童的总体发育情况,但是临床应用证明6~12月龄的该量表值与6~7岁的韦氏智力量表值显著相关[6],提示该量表在神经发育测试中的价值。
外来化学物质在体内的代谢转化是影响其健康效应的重要因素。在人体内,CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1负责PAHs的代谢活化;而GSTM1、GSTM3和GSTT2则参与PAHs解毒[7 – 9]。目前的研究主要集中在出生前母亲怀孕期间PAHs暴露对幼儿神经发育的影响。美国哥伦比亚大学研究团队调查了非裔、多米尼加和白种美国人3个不同民族母亲及幼儿上述基因的多态性对12、24和36月龄幼儿神经或智商发育的影响,研究结果显示,单纯的母亲或幼儿遗传因素对幼儿早期神经发育无显著性影响[10]。该研究着眼于孕期暴露,重点考虑出生前暴露对幼儿的影响。但是,人类大脑的快速发育期是从孕期的第3个月开始,至少一直持续到出生后2岁[11],因此出生后到2岁期间PAHs暴露同样可能影响到幼儿的神经发育,显然该时间段内幼儿的遗传因素参与了PAHs的代谢和解毒。连续变量单因素分析显示,多个代谢酶SNPs次要等位基因频率的纯合子基因型幼儿的发育商较杂合子和主要等位基因频率纯合子基因型的要高,提示遗传因素可能影响到幼儿的神经发育。但是,本研究中,次要等位基因频率的纯合子基因型幼儿数量较少,同时,以90分将DQs分为异常和正常,χ2 分析后无显著性差异,提示单纯的遗传因素对幼儿的神经发育影响可能较小。
美国哥伦比亚大学研究的另一个发现是母亲遗传因素和孕期PAHs暴露间的交互作用对幼儿的神经发育有显著性影响。例如,母亲的rs2606345(CYP1A1)、rs1056836(CYP1B1)和1056837(CYP1B1)都不能单独影响12月龄孩子的神经发育指数,但是这些遗传标志物与PAHs的交互作用具有统计学意义;6个基因的单倍体型与PAHs间的交互作用对神经发育影响也在3个不同种族队列研究中发现,尤以CYP1B1的ACCGGC影响最为显著[10]。该研究提示母亲PAHs代谢酶基因多态性能够与母亲PAHs暴露水平相互作用而影响到儿童神经系统的发育,但是该项研究没有考虑幼儿的遗传因素与幼儿期PAHs暴露的交互作用。下一步的研究需要在扩大样本量的同时,考虑幼儿环境PAHs的暴露,从而进一步观察幼儿PAHs代谢酶与幼儿期PAHs暴露间的交互作用。
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