德国小蠊（Blattella germanica）作为一种世界性卫生害虫，化学防制是目前控制其种群数量的主要手段。拟除虫菊酯类杀虫剂自20世纪80年代以来广泛应用于病媒昆虫的防制中，并逐渐产生抗药性，而确定抗药性的发生、发展及抗性水平对制定合理的化学防制措施至关重要。一些研究显示，在许多生物体内水解酶类与耐药性、抗逆性有关^{[1 – 3]}。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）是一类催化磷酸酯和磷酸核苷的非特异性水解酶，广泛存在于昆虫体内，在物质代谢中具有重要的作用^[4]。本研究针对溴氰菊酯对德国小蠊AKP活性影响的量效与时效关系，进一步探讨溴氰菊酯作用机制，为探索抗性原理和延长拟除虫菊酯类杀虫剂的使用寿命提供理论依据。

德国小蠊敏感品系（山东省疾病预防控制中心病媒生物防制所提供），选用羽化后健康成虫300头，随机分成6组，每组50头，对照组为无水丙酮处理，1～5组为药物处理组，所施药物浓度梯度依次升高。

95.95 %溴氰菊酯原药（德国Dr.Ehrenstorfer公司）；AKP测定试剂盒和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（带标准蛋白，南京建成生物工程研究所）；其他试剂均为国产分析纯产品。UV –1810型分光光度计（北京普通通用仪器有限责任公司）；电子天平HR – 120型（日本AND公司）；微量移液器（日本NICHIRYO公司）；Eppendorf 5417R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；电热恒温水浴锅（河北省黄骅市卸甲仪器厂）；JM – 2型医用喷头（上海松江华阳桥泾机电厂）；星豹牌空气压缩机（江苏金檀医疗设备厂）；标准密闭圆筒装置（内径20 cm，高43 cm；浙江余姚顺迪塑料模具厂）；胶塞；脱脂棉。

用无水丙酮将溴氰菊酯溶解并依次稀释成1.54、3.07、6.14、12.28和24.56 mg/L 5种死亡率 ≤ 30 %的亚致死浓度的溶液。参照国标GB/T 13917.1 – 2009《农药登记用卫生杀虫剂室内药效试验及评价》 ^[5]进行试验，密闭20 min后，将供试德国小蠊转入清洁的器皿中，用混合饲料和浸水脱脂棉球正常饲养。对照组使用无水丙酮处理，试验重复5次，并检查各组72 h的死亡率。

取喷药后24、48、72、96、120和144 h的单只德国小蠊用蒸馏水冲洗干净，快速在 – 20 ℃ 冷冻处死并称重，加入9倍体重的体积（重量体积比）含0.01 mol/L蔗糖、0.000 1 mol/L EDTA-2Na、0.01 mol/L Tris-HCL、0.8 % NaCL的缓冲液（pH = 7.4），用玻璃匀浆器冰浴匀浆，8 000 r/min离心5 min，取上清酶液冰浴待用。

严格按照AKP测定试剂盒说明进行测定，蒸馏水调零，实验重复5次。AKP活 $\text{性}({\rm{U/gprot}})=\displaystyle\frac{{\text{测定管吸光度}}}{{\text{标准管吸光度}}}\times {\text{标准光酚含量}}({\rm{0.03\;\;mg}})/$ ${\text{取样中蛋白克数}}({\rm{gprot/mL}})$ ； ${\rm{AKP}}\text{活性的抑制率}(\%)= $ $\dfrac{{\text{对照组}}{\rm{AKP}}{\text{活性}}- {\text{处理组}}{\rm{AKP}}{\text{活性}}}{{\text{对照组}}{\rm{AKP}}{\text{活性}}}\times 100\;{\%}$ 。

严格按照考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒进行测定，以标准蛋白（0.563 g/L）作标准，求出蛋白含量。

利用SPSS 13.0和Excel 2010 软件进行数据处理，同时用SPSS 13.0软件进行Independent-Samples t test检验。

表 1

表 1 5 种亚致死浓度的溴氰菊酯对德国小蠊72 h时死亡率（n = 5） 组别 浓度（mg/L） 72 h平均死亡率（%） 对照组 0 0.00 1组 1.54 5.00 2组 3.07 7.25 3组 6.14 12.50 4组 12.28 20.00 5组 24.56 27.50

表 1 5 种亚致死浓度的溴氰菊酯对德国小蠊72 h时死亡率（n = 5）

配制1.54、3.07、6.14、12.28和24.56 mg/L 5个亚致死浓度的溴氰菊酯溶液，施药后20 min内，虫体无目的运动增多，而且兴奋作用明显，运动中明显失去平衡，协调能力差，被击倒个体身体出现不同程度的扭动和弹动。20 min后，虫体运动减少，大多静伏。个体死亡均发生在 < 72 h，平均死亡率分别为5.00 %、7.25 %、12.50 %、20.00 %和27.50 %，对照组死亡率为0.00 %，72 h内致死率表明溴氰菊酯对德国小蠊敏感品系具有较强的致死作用，并呈现一定的剂量 – 效应关系。

表 2

表 2 不同浓度溴氰菊酯不同时间对德国小蠊AKP活性的影响（n = 5） 组别 施药浓度 （mg/L） 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h $\bar x \pm s$ 抑制率 （%） $\bar x \pm s$ 抑制率 （%） $\bar x \pm s$ 抑制率 （%） $\bar x \pm s$ 抑制率 （%） $\bar x \pm s$ 抑制率 （%） $\bar x \pm s$ 抑制率 （%） 对照组 0.00 13.67 ± 0.78 0.0 12.33 ± 0.38 0.0 11.16 ± 1.00 0.0 10.87 ± 0.66 0.0 11.76 ± 0.92 0.0 12.18 ± 1.20 0.0 1组 1.54 14.52 ± 1.32 a – 6.3 11.34 ± 0.45 8.1 9.09 ± 0.93 a 18.6 8.71 ± 1.06 19.9 10.84 ± 1.24 7.8 11.60 ± 1.06 4.8 2组 3.07 10.39 ± 0.89 a 24.0 10.02 ± 0.57 a 18.8 8.49 ± 0.55 a 23.9 8.46 ± 0.87 22.2 10.59 ± 0.96 9.9 11.16 ± 0.97 8.4 3组 6.14 11.59 ± 1.03 15.2 9.83 ± 1.26 a 20.3 8.63 ± 1.06 a 22.7 7.96 ± 1.24 26.8 10.35 ± 1.00 a 12.0 9.95 ± 0.49 18.3 4组 12.28 11.14 ± 0.54 18.5 9.23 ± 0.77 a 25.2 7.87 ± 1.11 a 29.5 9.32 ± 1.18 14.3 9.87 ± 1.30 16.1 10.81 ± 1.09 11.2 5组 24.56 10.17 ± 1.90 a 25.6 9.09 ± 0.96 a 26.2 8.12 ± 1.49 a 27.3 8.23 ± 0.84 24.3 9.52 ± 0.82 a 19.1 10.70 ± 0.81 12.2 　　注：a表示处理组与对照组酶活性差异显著（P < 0.05）；百分数为AKP活性的抑制水平。

表 2 不同浓度溴氰菊酯不同时间对德国小蠊AKP活性的影响（n = 5）

施药处理组与对照组进行比较，144 h内德国小蠊AKP活性在某个时间段变化差异显著（P < 0.05），表明溴氰菊酯对德国小蠊AKP有明显地抑制效应，且存在一定关系的量效和时效的作用。在监测时间内，随时间的延长，1、2、4、5组均表现为抑制率先增大后降至正常水平附近，至144 h时与正常水平无显著差异，这正有利于德国小蠊体内AKP活性水平的恢复，对德国小蠊的生存具有重要意义。不同施药浓度上，德国小蠊AKP活性在不同时间受到的抑制作用不同来看，溴氰菊酯对德国小蠊AKP活性的抑制作用呈现一定的浓度 – 效应关系和时间 – 效应关系。实验结果显示，不同浓度的溴氰菊酯对德国小蠊AKP的作用效应在时间上是不同的，药物的抑制作用与溴氰菊酯的浓度具有一定的正相关关系。

图 1

图 1 144 h内不同浓度的溴氰菊酯对德国小蠊AKP活性抑制率的变化

在浓度 – 效应方面，48 h至72 h内溴氰菊酯对德国小蠊AKP的抑制率随施药浓度的增加而增大。在时间 – 效应方面，72 h内随着施药浓度的增加，2、4、5组溴氰菊酯对德国小蠊AKP活性抑制作用也在增加，分别达到本组最高抑制率，依次为23.9 %、29.5 %、27.3 %；96 h时1、3组分别达到本组抑制率的最大值19.9 %、26.8 %；至施药144 h内，从1组至5组AKP的抑制率水平均接近正常水平（对照组）附近，且与对照组活性水平无显著性差异（ P > 0.05）。结果表明溴氰菊酯对德国小蠊AKP活性的抑制作用不仅呈现一定的浓度 – 效应关系而且显示出不同的时间 – 效应关系。

本实验结果显示，溴氰菊酯对德国小蠊AKP活性有明显的抑制作用且浓度和时间效应不同。施药监测一定时间内，随着施药浓度的增加，德国小蠊整个健康状况受到较大影响，AKP的诱导过程受阻，可能是由于大量的AKP参与对溴氰菊酯的水解作用，并参与一系列自身防御反应有关，使得AKP的正常酶活性部位受到抑制，活性显著降低，这也说明德国小蠊AKP活性受抑制程度与个体中毒死亡率呈正相关，同时表明德国小蠊体内AKP是溴氰菊酯的重要靶标之一。施药96 h之后，AKP活性抑制率逐渐回升，向正常水平靠拢，可能是由于AKP活性随着药物作用的减弱，活性部位的功能基团逐渐恢复到原来整体的构象，活性渐渐升高，这也势必造成德国小蠊对拟除虫菊酯类杀虫剂的耐药力增强和抗药性水平升高^[6]。酶活力的稳定性对生物代谢的稳定性至关重要，酶活力稳定性越高，生物代谢就越稳定，生物适应能力就越强，这对德国小蠊的生存具有关键性的意义。

本研究结果还表明德国小蠊AKP活性时序变化与对拟除虫菊酯类的抗性有关。而以往的研究中已经知道德国小蠊随着敌敌畏普通乳油浓度的增加，酶的抑制率逐渐升高，而在0.004 %浓度范围内对AKP的抑制率无显著性改变^[7]。陈巧云等^[8]在淡色库蚊对敌百虫的抗性研究中发现，AKP与对有机磷农药的抗性有关；林永丽等^[4]对德国小蠊的研究结果却与此相反，认为AKP可能与对拟除虫菊酯的抗性有关，而与对有机磷农药的抗性无关。本研究针对不同浓度的溴氰菊酯引起德国小蠊AKP活性的时序变化提示，在使用拟除虫菊酯类杀虫剂的过程中，必须考虑由此引起的德国小蠊耐药力变化问题，应合理控制用药浓度和科学制定施药时间，以延缓德国小蠊抗药性的出现和延长杀虫剂的使用寿命。以杀虫剂的作用机制和德国小蠊对杀虫剂抗药性产生的生化机制为基础，研究不同杀虫剂、不同的抗药性水平与AKP活性及其他解毒酶水平，为拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性机制研究及抗药性生化检测方法的建立提供具有十分重要的参考价值，但对于AKP分子构象是否发生变异还有待于进一步基于分子水平生化检测的研究。