2. 安徽省疾病预防控制中心
诺如病毒(norovirus,NOVs),又名诺瓦克病毒,是人类杯状病毒科、诺如病毒属的代表株。它是一类形态相似、抗原性不尽相同的病毒颗粒,是引起人类非细菌性急性胃肠炎的主要病毒之一。近年来,随着新变异株不断出现,诺如病毒感染,在全球范围内呈上升趋势,目前,世界范围内的流行株GII.4及出现于2014 — 2015年导致亚洲地区腹泻爆发的GII.P17_GII.17诺如病毒株,就是新的NOVs变异株。据不完全统计,每年因NOVs感染腹泻而导致死亡的儿童20万左右[1]。虽然GII.P17_GII.17诺如病毒株是近年新出现的变异株,但由于其感染人群数量多,危害比较大,目前,利用自组装病毒样颗粒蛋白(VLPs)系统,对诺如病毒的结构、作用机理等方面的研究越来越多。本文针对GII.17诺如病毒流行概况及分子进化特征研究进展综述如下。
1 诺如病毒生物学特征诺如病毒属于杯状病毒科的单股正链RNA病毒。病毒颗粒无包膜,其基因组全长约为7.7 kb,包括3个开放阅读框(open reading frame 1 – 3, ORF1~3)。ORF1编码包括RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase, RDRP)在内的6个非结构蛋白;ORF2、ORF3主要编码衣壳蛋白(virul protein 1, VP1)及小衣壳蛋白VP2[2]。VP1又分为壳区(shell domain,S区)和突出(protruding domain,P区)。P区又分为P1和P2区,含有抗原决定簇以及病毒受体结合位点。新出现的病毒变异株突变,与P2区有密切的关联性[3]。研究表明诺如病毒基因呈高度多样性,根据RDRP核苷酸或衣壳蛋白区氨基酸序列的差异,可以将诺如病毒分为至少GI-GVI 6个基因组[4],其中GII基因组又可分为不同基因型,其中至少有32个基因亚型(如GII.P16、GII.4、GII.17等)与人类的急性胃肠炎感染相关[5 – 6]。
2 GII.17流行概况近20年,NOVs GII.4毒株一直是引起全球急性胃肠炎爆发的主要病原,全球因NOVs引发的疫情中,有55 %~85 %均是由NOVs GII.4型变异株引起的[6],其它型别的病毒株虽有一定程度的流行,但多以散发病例报道为主[7],但自从2014 — 2015年,因NOVs感染导致亚洲大面积腹泻爆发,则是一种新变异株GII.P17_GII.17引起的。据GenBank中的VP1区核酸序列分析表明,诺如病毒GII.17毒株可分为3个亚簇:A簇,1978 — 2002年的GII.17,包括最古老GII.17_GUF_1978毒株及2015年香港的GII.17_NS682_2015毒株;B簇,2005 — 2009年的GII.17,主要包括1987年发现的流行于亚洲、欧洲和非洲的GII.17病毒株;C簇,2012 — 2014年的GII.17,主要是指川崎系病毒株[8 – 9],2013年8月分离的广东毒株GII.17_JM_GD_2013、2013年台湾株(AB983218)及2014年的日本株(KJ156329)也属C簇。在这3个亚簇中有多种类型的RDRP重组变异株。
1978年,法国的Guiana第一次报道GII.17感染,后来经研究发现其病原是一种新变异毒株,为GII.P4-GII.17。此后,非洲、亚洲、欧洲、南北美、丹麦等地区均出现整合株GII.P13_GII.17,GII.P16_GII.17,GII.P3_GII.17,感染零星病例的报道[9 – 12]。2013年发现于台湾和2014年发现于日本的GII.P17_GII.17也只是引起散发病例,而2014年底,在广东省的学校、工厂和幼儿园等地陆续发生了由新型变异株GII.P17_GII.17引起的急性胃肠炎疫情。与此同时,中国香港、江苏、台湾也出现GII.P17_GII.17感染病例的报道。GII.P17_GII.17感染病例85 %发生于学校,其次是工厂与幼儿园,发病与儿童、免疫力低下人群有高度相关性。诺如病毒感染病例中,小于5岁年龄组,5~65岁年龄组,大于65岁年龄组中,NOVs GII.17型病毒株感染所占比例分别为15.6 %、47.7 %、36.7 %。诺如病毒NOVs GII.17变异株的高感染人群主要为大龄儿童和成年人[13 – 14]。
3 G11.17诺如病毒分子进化机制遗传进化分析发现,过去的30年间,GII.17全基因组核苷酸的替代变化一直存在。其核苷酸替代变化速率非线性。1978年到2002年间,进化的速度比较慢,其速率为1.7 × 10–3。而2002年到2015年,进化的速度变快,其速率为4.4 × 10–2。研究表明,全基因组中,P2区域是核苷酸变化最为活跃的区域。自1978年至2015年,GII.17毒株VP1衣壳蛋白P2区域核苷酸,其替代速率平均为1.2 × 10–2。2014年的川崎系与之前的GII.17毒株相比,有15个核苷酸发生替代,其进化速率加速为3 × 10–2[9, 12 – 13],进化速率明显加快。而自1978年至2012年,世界范围内的流行株GII.4的VP1衣壳蛋白P2区域的核苷酸替代率仅为3.8 × 10–3,从基因水平分析,其毒株核苷酸变化处于相对平稳状态[13]。2014年以前,GII.17一直处于低流行态势,而2014 — 2015年期间,GII.P17_GII.17感染导致的腹泻在亚洲地区出现了爆发流行。其主要原因,可能是重组致使GII.17的VP1区核苷酸替代比较明显,演化速度加快,进而导致其受体识别位点、抗原表位发生改变,赋予GII.17快速传播和较强的感染力[15]。
3.1 RNA多聚酶(RDRP)重组重组是病毒基因组发生较大变化的一个重要原因。研究显示,1978 — 2014年,RDRP经历了多次重组。其中,GII.17毒株(1978 — 2002年流行株)的RDRP分别属于GII.P3、GII.P4、GII.P13亚型,GII.17毒株(2004 —2009年流行株)的RDRP则属于G11.P13、GII.P16亚型[16]。虽然,2014 — 2015年的GII.P17_GII.17毒株的RDRP与GII.P13、GII.P3的亲缘关系较近[17],但无论是步长值(bootstrap values,> 70 %)(进化分析树节点数值)或遗传距离(genetic distance,> 0.143)分析,GII.P17不能够归为以往的任何一个NOVs毒株亚型,因此,依据诺如病毒的系统分类,将其命名为新型NOVs毒株RDRP GII.P17亚型 [4]。GII.P17_GII.17 NOVs毒株的出现,造成2014 — 2015年亚洲地区诺如病毒大流行,而先前的NOVsGII.17重组株均为散发,并未造成大规模的爆发流行,其可能原因是2014 GII.P17毒株的RDRP使复制效率增加[18]。由于RNA病毒缺乏校正修复机制,复制过程中会使病毒的突变不断积累,其环境适应性趋于完善,导致具有爆发流行能力新毒株GII.P17_GII.17的出现[15]。
3.2 抗原变异抗原变异是诺如病毒进化的又一个重要动力。诺如病毒P2区域的核苷酸置换、插入、缺失的基因突变会导致抗原的漂移。此外,P2区域空间结构的改变可能也是影响因素。研究发现,NOVs毒株川崎2014株与传统GII.17(Hu/GII.17/C142/GF/1978、KC597139)衣壳蛋白VP1的核苷酸序列相比,其高变P2区域的同源只有30 %;与病毒株GII.17(2013 — 2014年流行毒株)相比较,P1区域同源性为97 %~98.1 %,高变区域P2的同源性却只有90.6 %~92.7 %[15]。川崎2014株的18 %VP1蛋白发生突变,其中86 %的替代和位置的插入全部位于P2域外表面。P2域外表面是抗原中和表位、受体组织血型抗原(histo-blood group antigens, HBGAs)的结合位点集中区域。其中第378位(相对于GII.4株的D378)、第397位(KU561250-KU561256)插入的氨基酸残基位置位于D抗原表位[19]。
P区域二聚体的表面结构组成对其受体蛋白的空间构象起着至关重要作用[20]。研究发现,Saitama/T87/2002的P区域空间结构是由不对称单聚体组成的。而川崎系P区域的空间结构主要为二聚体,其P1区包含一个β-片层(β-sheets)和1个α-螺旋(α-helix),P2区结构主要包含6个反向平行的β-strands形成的桶状结构[21]。P2区域核苷酸的突变及其区域蛋白空间结构的变化是否赋予新变异毒株的免疫逃避能力,还需要进一步研究加以确定。
4 GII.17侵袭力相关的HBGAs分子类型HBGAs是诺如病毒的天然受体或协同因子[13, 22],其主要存在于组织细胞表面或体液分泌物中,有3种类型的HBGAs(ABO型、Lewis型和分泌型),它们与诺如病毒的识别有高度相关性。2004年,巴拉圭的GII.17毒株与GII.4毒株一样,对5岁以下的儿童感染率均为18 %左右[23]。而在亚洲,GII.17的感染率远远低于GII.4,只呈零星感染状态。这意味着GII.17感染的HBGAs类型具有一定遗传性限制。研究发现2013年以前的GII.17感染患者的HBGAs类型多以O及B分泌型。然而2014 — 2015年GII.17毒株引起的疫情其发病规模、易感人数、严重程度均超过GII.4。2014年变异株GII.17感染的患者有非分泌型HBGAs存在[24]。
研究发现新的变异株GII.P17_GII.17的P2域的第378位出现氨基酸的插入[25 – 26]。川崎308系毒株的Tyr444蛋白及川崎323系毒株的Tyr442蛋白与GII.4毒株的Tyr444蛋白结构和功能具有相似性。此类蛋白的氨基酸残基上氢键与疏水作用力使诺如病毒能与HGBAs结合,突变此位点将会阻碍病毒与HGBAs结合。这些可能是GII.P17_GII.17毒株可以结合多种类型(A、B、O分泌型及非分泌型)HBGAs,导致侵袭能力增强的原因之一[24]。
5 GII.17流行传播模式研究显示,流行于1978 — 2002年的GII.17源自1966年祖先,现已很少监测到[19]。2015年香港分离一株GII.17_NS682_2015,经分析归属A簇,提示,此簇的毒株仍然与其它毒株处于共流行态势;2002 — 2009年的GII.17源自1987年流行于亚洲、欧洲的流行株。2009年喀麦隆从健康儿童样本的分离株以及2010 — 2011年南非水源性的流行株均属于此簇;流行于2012 — 2014年的川崎系源自2007年至2010年间流行于非洲的诺如病毒株,偶见于亚洲。2013年以后在中国、韩国、日本等部分亚洲国家频繁出现零星散发GII.17感染的病例报道,这意味着2013年的GII.17株已经在亚洲的部分国家建立起稳固的传播模式。导致2014年新的变异株GII.P17_GII.17在亚洲地区爆发。源自2013年GII.17的变异株形成了一大一小2个分支,小的分支源自广东,大的分支源自香港。大的分支以香港为疫情中心沿珠江带向广东及沿岸城市传播,形成了2014年的爆发疫情。
6 小 结近年来,诺如病毒新毒株不断出现并导致疾病爆发流行的原因,可归于病毒及其受体HBGAs正选择压力,宿主免疫压力的双重选择。这种双重压力下,诺如病毒的抗原类型,受体类型,结合模式发生明显变化,因而导致病毒毒力变化。诺如病毒基因组组成,蛋白结构功能,病毒的受体作用关键位点,分子进化机理方面取得的进展,为制备诺如病毒疫苗,采取措施防治诺如病毒新毒株的流行和爆发提供了理论依据。
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