十氯酮（chlordecone）又名开蓬（kepone），是一种人工合成的有机氯杀虫剂，作为环境中常见的一种持久性有机污染物，已被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》禁用名单^[1]。监测资料显示，我国东部十氯酮检出率较高^[2]，如锦州湾海域十氯酮检出率为100 %，十氯酮残留范围为0.34～10.69 ng/g^[3]，已接近甚至超过国际限定值0.01 mg/kg^[1]。研究显示，十氯酮可能与男性生殖功能障碍及儿童性发育异常等发生率逐年增加有关^{[4 – 5]}。秀丽隐杆线虫体内38 %蛋白编码基因与人类基因同源，且精子发生同样经过有丝分裂、减数分裂及精子形成3个阶段，与哺乳动物类似^[6]，已广泛应用于毒理学评价^{[7 – 8]}。线虫身体透明且生殖细胞位置相对固定，可应用显微技术直接观察体内生殖系统变化情况，从而有利于研究生殖细胞发生过程^[9]。氧化损伤是外源化学物造成机体毒性作用的重要机制之一^{[10 – 11]}。本研究应用线虫模型，通过分析受试虫株体内活性氧水平和后代数目、世代时间等指标的变化特征，探讨十氯酮暴露后氧化损伤与线虫生殖毒性关系。结果报告如下。

N2、DR466（him-5）、JK2868虫株（美国明尼苏达大学线虫遗传中心）。利用种有大肠杆菌OP50的培养基（NGM）在20 ℃恒温培养。

十氯酮（美国百灵威科技公司），二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、二脒基苯基吲哚（4′-6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（美国Sigma-Aldrich公司），酵母提取物、胰蛋白胨（英国OXOID公司），链霉蛋白酶（pronase）（瑞士Roche公司）。Olympus SZ61体视显微镜、Olympus BX41生物荧光显微镜（日本Olympus公司）。

将十氯酮溶解在DMSO中，配制成1 mg/mL储备液，用无菌线虫缓冲液（M9溶液）稀释成所需染毒浓度，根据LC₅₀实验结果及国际限定值设计4个剂量组，分别为0.02、0.20、2.00、20.00 μg/L，试验同时设置M9溶液对照组。将配制好的染毒液滴200 μL到已种好OP50 NGM培养基的24孔板，然后将幼虫1期秀丽线虫加入染毒孔中，在20 ℃恒温培养箱中染毒48 h。

染毒后的N2线虫，单独挑入新NGM培养皿中产卵（每皿1条），期间每隔36 h转至新的培养皿，直至停止产卵为止，计数每条线虫产生的后代数目。每个剂量组统计10条线虫后代数目，实验重复3次。

染毒后的N2线虫，单独挑入新的NGM培养皿中产卵（每皿1条），观察并记录线虫成虫产第一枚卵的时间，记为A，此后将线虫挑出并继续观察该卵发育长成成虫后，其产出第一枚卵的时间，记为B，B和A的时间间隔即为线虫的世代时间。

将染毒后的him-5雄虫转移到1 mL含10 μmol/L浓度CM-H2DCFDA探针溶液中，20 ℃培养2.5 h后移至载玻片上，盖上盖玻片，在生物荧光显微镜下观察拍照，镜下活性氧显示亮绿色标记。

在制备好的载玻片上滴加20 μL叠氮纳溶液，将染毒后的JK2868线虫挑入，盖上盖玻片，在生物荧光显微镜下观察单侧性腺远端顶细胞（distal tip cell，DTC），并分析DTC细胞的荧光强度，每个剂量组观测10条，实验重复3次。

移液枪吸取200 μL含him-5线虫的染毒液至预先准备好的玻片上，用90 %乙醇洗脱3次后滴加20 μL（2 μg/mL）DAPI，染色10 min，盖上盖玻片，于生物荧光显微镜下计数雄虫性腺有丝分裂区细胞。每个剂量组统计10条线虫，实验重复3次。

将染毒后him-5线虫雄虫转移至新鲜含OP50 NGM培养基中培养12 h以使雄虫体内精子含量增加。在载玻片滴上10 μL含BSA缓冲液，挑入雄虫，显微镜下使用注射器尖端从尾部1/3处截断释放精子，观察精细胞形态（正常精细胞为圆形），每只线虫计数100个精细胞。

在载玻片上滴10 μL含pronase（200 μg/mL）缓冲液，挑入5～10条染毒后him-5雄虫至缓冲液中，用注射器尖端从线虫尾部1/3处截断，释放精子，10 min后观察精子能否形成正常伪足，随机选取若干视野计数，每条线虫计数100个精子，计算其活化率。

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料用 $\bar x \pm s$ 表示，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析，组间两两比较时，若方差齐，采用Student-Newman-Keuls检验；若方差不齐，采用Games-Howell检验；检验水准为 α = 0.05。

结果显示，与对照组比较，各剂量十氯酮组N2线虫后代数目均减少，2.00、20.00 μg/L十氯酮组N2线虫世代时间延长，差异有统计学意义（P < 0.05）。

表 1

表 1 十氯酮对N2线虫后代数目和世代时间影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 10） 组别（μg/L） 后代数目（个） 世代时间（h） 对照组 335.60 ± 21.31 55.80 ± 1.94 十氯铜 0.02 308.60 ± 19.60a 56.40 ± 1.59 　　　 0.20 306.00 ± 11.23a 56.70 ± 0.91 　　　 2.00 260.10 ± 27.41a 60.85 ± 0.94a 　　　20.00 255.00 ± 13.72a 69.60 ± 1.96a 　　注：与对照组比较，a P < 0.05。

表 1 十氯酮对N2线虫后代数目和世代时间影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 10）

对照组、0.02、0.20、2.00、20.00 μg/L十氯酮组him-5线虫雄虫体内活性氧水平（荧光强度）分别为（1.00 ± 0.94）、（3.00 ± 0.94）、（5.20 ± 2.49）、（9.50 ± 2.80）和（15.90 ± 4.61）；与对照组比较，2.00、20.00 μg/L十氯酮组him-5线虫雄虫体内活性氧水平明显升高（P < 0.05）。

图 1

注：A、B、C、D分别为0.02、0.20、2.00、20.00 μg/L十氯铜组，E对照组；1 明场，2 荧光。 图 1 十氯酮对him-5线虫雄虫体内活性氧水平影响（× 100）

对照组、0.02、0.20、2.00、20.00 μg/L十氯酮组JK2868线虫体内DTC细胞荧光强度分别为（65.80 ± 8.92）、（39.60 ± 11.78）、（33.00 ± 10.66）、（16.70 ± 1.25）和（16.90 ± 4.36）；与对照组比较，十氯酮各剂量组JK2868线虫体内DTC细胞荧光强度明显减弱（P < 0.05）。

图 2

注：A、B、C、D分别为0.02、0.20、2.00、20.00 μg/L十氯铜组，E对照组。 图 2 十氯酮对JK2868线虫DTC细胞荧光强度影响（× 200）

对照组、0.02、0.20、2.00、20.00 μg/L十氯酮组him-5线虫雄虫体内性腺有丝分裂区生殖细胞数分别为（87.90 ± 3.75）、（75.90 ± 3.47）、（74.40 ± 4.50）、（54.70 ± 2.98）和（47.90 ± 5.42）个；与对照组比较，十氯酮各剂量组him-5线虫雄虫体内性腺有丝分裂区生殖细胞数明显降低（P < 0.05）。

图 3

注：A、B、C、D分别为0.02、0.20、2.00、20.00 μg/L十氯铜组，E对照组。 图 3 十氯酮对him-5线虫有丝分裂区生殖细胞数影响（× 1 000）

结果显示，与对照组比较，0.20、2.00、20.00 μg/L十氯酮组him-5线虫雄虫精细胞非圆形率明显升高（P < 0.05）。十氯铜组him-5线虫精细胞可见不规则图形且细胞边缘不圆滑，精细胞分离后，可使用pronase进行体外活化，精细胞发育为具有伪足的精子；与对照组比较，各剂量十氯铜组him-5线虫精子活化率明显下降（ P < 0.05）。

表 2

表 2 十氯酮对him-5雄虫精细胞形态及活化率影响（%， $\bar x \pm s$ ，n = 100） 组别（μg/L） 非圆形精细胞百分率 精子活化率 对照组 12.70 ± 1.16 77.00 ± 9.82 十氯铜 0.02 17.40 ± 2.12 57.50 ± 2.55a 0.20 39.80 ± 4.32a 49.80 ± 6.30a 2.00 54.30 ± 9.07a 28.10 ± 4.61a 20.00 84.00 ± 7.29a 8.70 ± 2.41a 　　注：与对照组比较，a P < 0.05。

表 2 十氯酮对him-5雄虫精细胞形态及活化率影响（%， $\bar x \pm s$ ，n = 100）

十氯酮是一种极难降解的持久性有机污染物，具有多种毒性。有研究表明新生发育期的大鼠暴露于十氯酮后，可出现生育期繁殖能力下降以及性别分化的症状^[12]。流行病学研究发现，婴儿出生后的体重、生长情况与其母亲孕产期是否暴露于十氯酮相关^[13]。提示，十氯酮可能对人类生殖发育系统有潜在影响。秀丽隐杆线虫生长周期短、繁殖能力强、易于饲养，线虫精子发生过程背景清晰且与哺乳动物相似^[6]。本研究选择L1期幼虫染毒48 h至L4期精子发育成熟，结果显示，暴露于十氯酮48 h后，线虫后代数目减少，世代时间延长，表明线虫生殖发育系统对十氯酮具有一定敏感性。

研究表明氧化损伤是外源化学物产生生殖毒性效应的重要机制^{[14 – 15]}，大量的活性氧诱导机体组织的氧化损伤，继而导致器官发育异常，功能退化。本研究结果显示，十氯酮暴露后，线虫体内活性氧水平升高，且呈剂量效应关系。这可能是导致细胞周期阻滞，造成生殖细胞数目减少及性腺损伤的重要因素^[16]。性腺作为生殖细胞发育场所，距离性腺背侧最近的细胞为DTC细胞，在线虫性腺形态发生过程中，性腺的最终形状及大小由DTC细胞移动决定^[17]。JK2868线虫突变株的DTC细胞具有自发绿色荧光，可用于评价外源化学物对线虫性腺结构的毒性。本研究结果显示，随着十氯酮暴露剂量的增加，DTC细胞荧光强度减弱，并与线虫体内活性氧水平密切相关。提示，性腺是十氯酮生殖毒性作用的靶点，氧化应激损伤可影响性腺结构的正常发育，从而导致精细胞发育的营养缺失，有丝分裂区生殖细胞数目减少。

线虫精细胞发育由初级精母细胞经2次减数分裂后形成4个圆形精子细胞^[18]。本研究结果显示，十氯酮染毒48 h后，与对照组比较，染毒组精细胞非圆形率明显降低。提示，十氯酮可能影响次级精母细胞（第2次减数分裂形成）出芽形成圆形精子细胞这一过程。有研究发现精子竞争力不仅与大小还与精子形态有关，畸形精子更不易完成受精过程^[19]。当圆形精子细胞受到信号刺激，发生剧烈的生理变化，精子细胞开始活化，形成伪足，最终成为具有运动能力的精子^[20]。本研究结果显示，与对照组比较，十氯铜组线虫精子活化率均明显下降。提示，十氯酮可能通过影响精子特异复合物（FB-MO）的转运从而抑制精子形成伪足最终导致精子活化异常，形成不具备运动能力的异常精子。

综上所述，十氯酮对秀丽隐杆线虫具有生殖毒性作用，可使线虫性腺结构损伤，精子形态异常，有丝分裂区生殖细胞数目减少，精子活化水平降低；其机制可能与氧化应激损伤有关。