汉坦病毒（Hantaan virus，HV）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，是有包膜、分节段的单股负链RNA病毒^[1]。其自然宿主以小型啮齿动物为主，并经由啮齿类动物传染给人类，在临床上可引起人的肾综合征出血热^[2]。每年亚洲和欧洲有近6～10万例汉坦病毒感染记录，其中大多来自中国。目前，关于汉坦病毒的检测方法主要有血清学检测方法和核酸检测方法^[3]。环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）方法是一种新的核酸扩增方法，具有高灵敏度、高特异性、操作简便及反应快速的特点^[4]。本研究针对汉坦病毒汉滩型S片段基因，建立LAMP检测方法，为汉坦病毒的流行病学调查及诊断提供新的方法。

汉坦病毒HTN型76–118株及SEO型80–39株为本实验室保存。汉坦病毒阳性血液组织5份采集自汉坦病毒阳性携带者，本实验室保存。乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）和（经ELISA法鉴定）艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）标准品由中国人民解放军军事医学科学院提供。

荧光等温扩增仪GENE II型（英国OptiGene公司），超微量分光光度计NanoDrop2000型（美国Thermo公司），Isothermal mix（2 ×）（英国OptiGene公司），EasyPure Blood RNA Kit试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），pUC57-T载体（上海生工生物工程有限公司），EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）。

根据GeneBank中汉坦病毒HTN型76–118株S片段全序列（Accession：KT885049.1）和SEO型80–39株S片段全序列（Accession：NC_005236.1）体外合成2个大小分别为1 696 bp和1 769 bp的基因片段。合成的2个基因片段分别连接到克隆载体pUC57载体上（上海生工生物工程有限公司合成），构建标准质粒pHTN-S和pSEO-S。

针对汉坦病毒HTN型76–118株S片段全序列和SEO型80–39株S片段全序列，使用在线网站（http://primerexplorer.jp/e/）进行LAMP引物设计，序列如表1：

表 1

表 1 LAMP扩增引物 引物 序列 F3 5′-GTTATGGTAATGTGCTGGATT-3′ B3 5′-GCTATCATCCTTAAATCGAATCC-3′ FIP 5′-AGACGATGATGCTCAGCCAGTTTACCATTTGGATATTGATGAACCTA-3′ BIP 5′-TCTTACATCCTTTGTCGTCCCGTTTATCCTTGGTAGTTTGCCTC-3′

表 1 LAMP扩增引物

分别以合成的标准质粒pHTN-S和pSEO-S为模板，以设计合成的LAMP扩增引物进行LAMP扩增反应，建立总体积为25 μL的反应体系：Isothermal mix（2 ×）12.5 μL、F3（10 μmol）1 μL、B3（10 μmol）1 μL、FIP（40 μmol）1 μL、BIP（40 μmol）1 μL、标准质粒/cDNA 1 μL、去离子水7.5 μL。将反应溶液混匀，放入荧光等温扩增仪，设置反应温度63 ℃，反应时间50 min。

将合成的标准质粒采用NanoDrop2000超微量分光光度计进行定量，定量后使用去离子水分别对标准质粒进行连续10倍梯度稀释，以1.3.3中建立的LAMP体系检测不同稀释度下的质粒，确定引物对不同标准质粒的检测限。

分别以合成的2种标准质粒、HBV、HCV和HIV为模板，以1.3.3中建立的反应体系进行LAMP扩增，确定该反应体系的特异性。

血液组织RNA提取　方法参照EasyPure Blood RNA Kit试剂使用说明。取400 μL新鲜抗凝血液，加入1 mL细胞裂解液RCL2溶液，混匀后冰育10 min。4 ℃下5 000 × g离心10 min，弃上清。加入400 μL结合缓冲液BB7溶液，漩涡振荡后加入200 μL无水乙醇，采用离心株吸附总RNA，4 ℃下10 000 × g离心1 min。加入500 μL洗脱液WB7，4 ℃下10 000 × g离心1 min。向吸附柱中加入100 μL无RNA酶去离子水，室温静置1 min，室温下10 000 × g离心1 min，洗脱RNA，采用NanoDrop2000超微量分光光度计进行定量，– 80 ℃保存RNA。反转录合成cDNA方法参照试剂盒使用说明。建立如下反应体系：RNA 3 μg、Olig（dT）₁₈ 1 μL、2 × ES Reaction Mix 10 μL、EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL、gDNA Remover 1 μL、无RNA酶去离子水至20 μL。混匀反应体系，42 ℃孵育30 min。85 ℃加热5 s失活酶之后– 30 ℃保存样品。以反转录合成的cDNA为模板，采用方法1.3.3中的引物与体系进行样本LAMP检测。

以合成的标准质粒为模板，进行LAMP扩增，标准质粒pHTN-S能够发生LAMP扩增，而以pSEO-S为模板，则不能发生LAMP扩增，证明该套引物只能检测汉坦病毒汉滩型S片段，而不能扩增汉坦病毒汉城型S片段，能够区分汉坦病毒汉滩型和汉城型，具有良好的特异性。

图 1

图 1 汉坦病毒S片段标准质粒LAMP扩增

将标准质粒pHTN-S进行10倍梯度稀释，分别10⁴ copy/μL稀释到10⁰ copy/μL，以方法1.3.3中的引物与体系进行LAMP检测。当模板质粒稀释到10¹ copy/μL时依然能够发生LAMP扩增，而当稀释到10⁰ copy/μL时则不能发生LAMP扩增。表明该套引物对标准质粒pHTN-S的检测限为10¹ copy/反应，此时，LAMP反应中标准质粒pHTN-S的量为10 copy/反应。

图 2

图 2 标准质粒的LAMP检测限

分别以pHTN-S、pSEO-S、HBV、HCV和HIV为模板，以建立的LAMP体系方法进行LAMP扩增。只有以标准质粒pHTN-S为模板时能够发生LAMP扩增，而其他4种病毒模板均不能发生LAMP扩增。表明，该套体系和方法对汉坦病毒汉滩型具有良好的特异性。

图 3

图 3 LAMP反应特异性检测

以经过ELISA检测汉坦病毒阳性的血液样本提取并合成的cDNA和标准质粒pHTN-S为模板，以建立的LAMP扩增体系进行检测。提取合成的5个血液样品cDNA均能够发生LAMP扩增，证明该方法体系能够用于血液样品中汉坦病毒感染的检测。

图 4

图 4 血液样品中汉坦病毒的LAMP检测

在临床中，针对汉坦病毒的检测方法主要采用血清学方法，包括酶联免疫测定法（ELISA）和免疫荧光法（immunofluorescence assay，IFA）。在分子生物学检测方法中，最常用的是荧光定量PCR法（real-time PCR）。而经典的病毒滴定法由于其耗时较长（5～7 d）在临床中则很少使用。基于SYBR-Green I的反转录real-time PCR法（real time quantitative PCR，RT-qPCR）被认为是目前操作简单，灵敏度最高的一种基因检测方法，但是该方法必须依赖于荧光定量PCR仪^{[3, 5 – 6]}。LAMP法是近年来开发出的一种新型基因检测方法，该方法针对扩增的目的基因，设计4条特异性引物进行等温扩增^[7]。LAMP法具有与real-time PCR法相近的检测灵敏度，并且操作方法简单，只需恒温水浴即可进行，不依赖于昂贵的实验仪器。并且该检测方法特异性较高，检测时间只需30～60 min，扩增结束后结果可以采用多种方法进行鉴定，与real-time PCR法相比具有显著的优点。目前，LAMP法已经广泛应用于各类生物学样品中特定基因的检测，尤其是针对病毒基因的检测。

在本研究中，针对汉坦病毒汉滩型S片段的保守区，设计4条特异性引物，建立一种针对汉滩型汉坦病毒的LAMP检测方法。本方法首先构建标准质粒，利用设计合成的4条特异性引物建立LAMP扩增体系。在对标准质粒的检测中，该方法能够检测汉坦病毒汉滩型S片段标准质粒，而对汉坦病毒汉城型S片段标准质粒则没有扩增，表明该方法中采用的引物对汉坦病毒汉滩型具有特异性，可以区分汉坦病毒的2种基因类型。进一步的检测限分析表明，建立的LAMP法对汉坦病毒汉滩型的检测限为10 copy/反应，具有与real-time PCR法相近的灵敏性^{[8 – 9]}。特异性分析表明，建立的LAMP体系方法只能扩增汉坦病毒汉滩型标准质粒，而对汉坦病毒汉城型标准质粒、HBV、HCV和HIV病毒等均无特异性扩增，表明该方法具有良好的特异性。并且，采用该方法可以检测到血液样品中的汉坦病毒感染，证明建立的LAMP扩增方法可以用于检测生物学样本中的汉滩型汉坦病毒。为进一步将LAMP法应用于汉坦病毒基因检测奠定了研究基础。