胰岛素抵抗常常与内皮功能障碍同时出现^[1]，二者互为因果，互相影响，贯穿于糖尿病大血管病变发生发展的始终。前期研究表明，六黄合剂能够增强胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感性^[2]，而且对大鼠胸主动脉内皮细胞具有一定的保护作用^[3]。磷脂酰肌醇3–激酶（phosphatidylinositol3-kinase/ protein kinase B （PI3-K/Akt）信号通路在胰岛素信号传递中起重要作用^[4]，PI3-K/Akt信号通路障碍不仅能导致胰岛素抵抗，也是血管内皮功能发生障碍的原因之一。本研究拟从PI3-K/Akt信号通路来探讨六黄合剂对血管内皮保护的作用机制。

SPF级（Sprague-Dawley） SD大鼠40只，雄性，体重180～220 g，由辽宁省长生生物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK（辽）2015-0001。所有大鼠均适应性喂养1周，自由摄水，标准饲料喂养，明暗周期为12h（7:00～19:00），温度控制在（23 ± 2）℃，相对湿度（55 ± 5） %。动物随机分为空白组、模型组、六黄合剂组、罗格列酮组，每组10只。

ETC-811扩增仪，东胜龙公司；FQD-96A荧光定量PCR仪，博日公司。六黄合剂由黄芪、黄精、姜黄、蒲黄、黄连和大黄等颗粒按适当比例冲制而成，药材购自江阴天江药业有限公司；地塞米松磷酸钠注射液，国药集团容生制药有限公司；罗格列酮片，成都恒瑞制药有限公司；高脂饲料，北京科澳协力饲料有限公司；RNAiso Plus，TAKARA公司；GoScript^TM Reverse Transcription System，Promega公司；GoTaq^® qPCR Master Mix，Promega公司。

除空白组喂饲标准饲料，其余3组均给予高脂饲料喂养5周，之后，模型组、六黄合剂组、罗格列酮组大鼠肌注地塞米松磷酸钠注射液，剂量为1 mg/kg，隔日注射1次，共7次^[5]；空白组肌注等体积生理盐水。通过测量大鼠空腹血糖，血清胰岛素水平，计算胰岛素敏感指数，判断造模成功。所有大鼠自由摄水。在造模的同时，六黄合剂组灌胃相应的药物（6.3 g/kg），罗格列酮组灌胃相应的药物（3 mg/kg），空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水，给药容量为10 mL/kg，总计给药7周。

实验结束，大鼠禁食12 h后，断头处死，剥离胸主动脉，检测胸主动脉PI3-KmRNA、AktmRNA和eNOS mRNA的表达水平：使用Qiagen（74104）试剂提取总RNA，并用Promega（A5001）试剂进行反转录反应得到cDNA。PCR扩增的基因引物序列由NCBI primer primer5软件设计并由Lifetech公司合成。加入含荧光染料的GoTaq^® qPCR Master Mix，对模板采用实时荧光定量PCR（real-time reverse transcription -PCR, RT-PCR）法进行相对定量分析。PCR反应条件: 95℃ 10 min, 95℃ 15 s, 60℃ 1 min共计40个循环, 同时各循环均采集荧光信号, 循环结束后4℃保存。根据PCR产物熔解曲线确定产物的纯度。如果产物特异, 熔解曲线无杂峰, 平均熔解温度一致。PCR扩增的基因引物序列如下（表1）。

表 1

表 1 PCR扩增的基因引物序列 基因 引物序列（5′-3′） 产物长度 β-actin 上游引物ACGGTCAGGTCATCACTATCG 155 下游引物GGCATAGAGGTCTTTACGGATG PI3-K 上游引物CAAAGCCGAGAACCTATTGC 237 下游引物TTGAGGGAGTCATTGTGCTG Akt 上游引物TGGACTACTTGCACTCCGAG 150 下游引物CGCAGAACGTCTTCATGGTG eNOS 上游引物TGAGGCCTTGGTATTGGTGG 294 下游引物CAGAAGTGCGGGTATGCTCT

表 1 PCR扩增的基因引物序列

所有数值以 $\bar x$ ± s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，P < 0.05 为差异有统计学意义。

与空白组相比，模型组胸主动脉PI3-K mRNA的表达水平明显降低（P < 0.01）。与模型组相比，罗格列酮组胸主动脉PI3-KmRNA的表达水平升高（ P < 0.05），六黄合剂组胸主动脉PI3-KmRNA的表达水平也升高，差异无统计学意义。六黄合剂组和罗格列酮组胸主动脉PI3-KmRNA的表达水平均低于空白组，但与空白组差异不显著。与空白组相比，模型组胸主动脉Akt mRNA的表达水平明显降低（ P < 0.01）。药物作用后，六黄合剂组和罗格列酮组与模型组相比，均能升高胸主动脉Akt mRNA的表达水平（ P < 0.05）。六黄合剂组和罗格列酮组胸主动脉Akt mRN的表达水平均低于空白组，但与空白组差异不显著。与空白组相比，模型组胸主动脉eNOS mRNA的表达水平明显降低（ P < 0.01）。药物治疗后，与模型组相比，六黄合剂组胸主动脉eNOS mRNA的表达水平升高，但差异不显著；罗格列酮组胸主动脉eNOS mRNA的表达水平比模型组明显升高（ P < 0.01）。六黄合剂组和罗格列酮组胸主动脉eNOS mRNA的表达水平均比空白组低，但是罗格列酮组的差异无统计学意义，六黄合剂组的差异显著（ P < 0.05）。

表 2

表 2 各组大鼠胸主动脉PI3-KP85a mRNA、Akt mRNA和eNOS mRNA的表达水平（ $\bar x$ ± s，n = 10） 组别 PI3-K mRNA Akt mRNA eNOS mRNA 空白组 1.40 ± 0.41 0.23 ± 0.04 1.24 ± 0.32 模型组 0.70 ± 0.24d 0.14 ± 0.03d 0.60 ± 0.22d 六黄合剂组 1.07 ± 0.31 0.20 ± 0.05a 0.87 ± 0.27ｃ 罗格列酮组 1.17 ± 0.25a 0.21 ± 0.05a 1.11 ± 0.21ｂ F值 4.432 4.253 5.853 P值 0.019 0.022 0.007 　　注: 与模型组比较，a P< 0.05, bP< 0.01；与空白组比较，cP< 0.05，dP< 0.01。

表 2 各组大鼠胸主动脉PI3-KP85a mRNA、Akt mRNA和eNOS mRNA的表达水平（ $\bar x$ ± s，n = 10）

血管内皮是胰岛素作用的靶组织^[6]，胰岛素通过PI3-K/Akt信号通路发挥对血管内皮的保护作用。胰岛素与血管内皮细胞上的胰岛素受体结合，使胰岛素受体底物（insulin receptor substrate, IRS）磷酸化，磷酸化的IRS与PI3-K结合，催化磷脂酰肌醇–4, 5–二磷酸生成磷脂酰肌醇–3,4,5–三磷酸（phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate, PIP3），PIP3作为第二信使激活Akt（蛋白激酶B, PKB），进而激活eNOS，促进内皮源性nitric oxide （NO）的生成^[7]，发挥胰岛素的扩血管作用。研究表明，糖尿病初期胰岛素抵抗阶段，血管内皮功能已经出现障碍，主要表现是NO生物活性下降而导致的血管内皮依赖性舒张功能受损。我们前期研究也表明，胰岛素抵抗大鼠的血清NO水平下降, 血管内皮出现病理性损害^[3]。本研究进一步证明，在胰岛素抵抗大鼠的胸主动脉内皮细胞上的PI3-K/Akt信号通路发生了障碍，大鼠胸主动脉PI3-KP85a mRNA、Akt mRNA和eNOS mRNA的表达水平均明显下降。

临床治疗胰岛素抵抗的药物如罗格列酮，不仅能提高胰岛素的敏感性，而且能够改善内皮的功能^[8]。本课题组的前期研究也表明，六黄合剂和罗格列酮都能增强胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感性^[2]，并且使血清NO水平明显升高^[3]。PI3-K/Akt通路是胰岛素信号转导的主要通路，PI3-K和Akt是该通路上的标志性蛋白，该通路通过信号转导不仅发挥胰岛素对内皮的保护作用，也影响细胞的生长，增殖，分化，运动，生存和代谢^[9]。本研究结果显示，六黄合剂能够提高胰岛素抵抗大鼠胸主动脉PI3-KP85a mRNA、Akt mRNA和eNOS mRNA的表达水平，对PI3-K/Akt信号通路起着正向调节作用。因此，六黄合剂可能通过上调PI3-KmRNA和Akt mRNA的表达水平，促进PI3-K和Akt的蛋白表达，进一步提高eNOS mRNA的表达水平和eNOS蛋白的表达，使内皮细胞释放NO，从而改善内皮功能障碍。