2018, Vol. 34
邻苯二甲酸酯类（phthalate esters，PAEs）是典型内分泌干扰物，有急性毒性[1]、生殖发育毒性[2 – 3]、糖代谢紊乱疾病[4 – 5]等。其最常用于塑料产品的增塑剂，易于迁移，已经在粉尘、地表水和土壤等中检出。水中PAEs前处理技术包括固相萃取、微萃取、膜萃取，液相微萃取和搅拌棒吸附萃取等，检测技术主要有气相色谱法和液相色谱法，其中最普遍使用的是气相色谱–质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[6]。本研究于2016年1 — 2月采集福建省福州某医院血液透析科、闽江、居民家中和某大型超市水样各1 L，参考邱歆磊[7]方法，建立水中16种PAEs稳定性同位素内标–自动固相萃取-GC-MS检测方法。
1 材料与方法 1.1 主要仪器和设备全自动固相萃取仪AUTO SPE-06D（厦门睿科Reeko公司），气相色谱–质谱联用仪（美国Agilent公司，6890/5973i GC-MSD）；色谱柱HP-5MS（0.25 mm × 30 m × 0.25 μm，美国Agilent公司）；氮吹浓缩仪N-EVAP-111（美国Organomation Associates公司）；马弗炉（北京美诚公司）。
1.2 试剂与耗材正己烷（色谱纯，德国Merck公司），二氯甲烷（色谱纯，美国ACS恩科化学公司），甲醇（色谱纯，德国Merck公司）和丙酮（色谱纯，韩国Duksan公司）；有机试剂均需重蒸处理。固相萃取柱Supelclean ENVI-18（6 mL/500 mg，美国Supelco公司），Welchrom C18E（6 mL/1 000 mg，上海Welch公司），HC-C18 glass（6 mL/1 000 mg，德国CNW公司），Florisil PR（6 mL/1 000 mg，美国Agilent公司），Sep-Pak C18（6 mL/500 mg，美国Waters公司），HLB（6 mL/500 mg，天津力瑞公司）。
1.3 外标储备液、中间液与使用液16种PAEs混合标准品（1.0 mg/mL，custom phthalates mix, 116767-01-1ML上海安谱公司）包括：邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，DIBP）、邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、邻苯二甲酸二（2–甲氧基）乙酯（di（2-methoxyethyl） phthalate，DMEP）、邻苯二甲酸二（4–甲基–2–戊基）乙酯（bis（4-methyl-2-pentyl）phthalate，BMPP）、邻苯二甲酸二（2–乙氧基）乙酯（Di（2-ethoxyethyl） phthalate，DEEP）、邻苯二甲酸二戊酯（dipentyl phthalate，DPP）、邻苯二甲酸二己酯（dihexyl phthalate，DHXP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（benzyl butyl phthalate，BBP）、邻苯二甲酸二（2–丁氧基）乙酯（2-butoxyethyl）phthalate，DBEP）、邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexyl phthalate，DCHP）、邻苯二甲酸二（2–乙基）己酯（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）、邻苯二甲酸二苯酯（diphenyl phthalate，DPnP）、邻苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DNOP）、邻苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DNP）；移取1.0 mL的外标储备液（1.0 mg/mL），用丙酮定容至50.0 mL，即为浓度为20.0 μg/mL的中间液。移取1.0 mL中间液，用丙酮定容至10.0 mL，即为浓度为2.0 μg/mL的使用液。
1.4 内标储备液、中间液与使用液分别称取D4–邻苯二甲酸二丁酯（D4-DBP，D4-DEHP，Dr.Ehrenstorfer GmbH，93 %）和D4–邻苯二甲酸二（2–乙基）己酯（D4-DEHP，Dr.Ehrenstorfer GmbH，93 %）标准11.31 mg，丙酮定容至10.0 mL，配制成内标储备液，浓度1.13 mg/mL。再用丙酮梯度稀释为11.3 μg/mL的内标使用液。
1.5 样品采集、处理与分析（表1）2016年1 — 2月于福州某医院血液透析科、闽江、居民家中和某大型超市分别采集透析水（reverse osmosis, RO反渗）、闽江水（地表水源水）、管网末梢水（生活饮用水）和瓶装饮用水（地下水）。参考GB/T 5750.8–2006《生活饮用水标准检验方法 有机物指标》附录B[8]，采样容器为玻璃容器，采样量为1 L，4 ℃保存与运输，2周内测定。如果水样有杂质，要经过0.45 μm孔径的滤膜过滤，采集自来水样时加入约40～50 mg亚硫酸钠脱氯。在水样采集、运输、储存和处理过程中，尽量使用玻璃容器或器皿。普通玻璃器皿在350 ℃下烘烤6 h，而计量器皿使用时用丙酮清洗3次。GC-MS分析时源于样品基质中的共流离子可能会影响分析物的鉴定，采用质谱全扫描（50～350 m/z）的方式进行确证。确认全自动固相萃取仪的溶剂与气路连接正常，移取200.0 mL的水样，并加入4 μL C18同位素内标使用液（11.3 μg/mL），混匀后上样。GC-MS参数进样口温度：250 ℃；进样模式：不分流进样，恒流模式；载气：He；流量：1.0 mL/min；升温条件：60 ℃（1 min），以15 ℃/min升至220 ℃，再以5 ℃/min升至290 ℃（8 min）。离子源：EI；电子能量：70 eV；接口温度：280 ℃；离子源温度：150 ℃；四极杆温度：150 ℃；溶剂延迟：8.0 min；选择离子监测（selectedion monitoring, SIM）。
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表 1 全自动固相萃取参数 |
1.6 统计分析
保留时间（RT）与质谱定性，内标法定量，计算方法检出限（method detection limit, MDL）、定量限（limit of quantitation, LOQ）。同时计算加标回收率（%）与相对标准偏差（Relative standard deviation, RSD）进行方法验证。水样中邻苯二甲酸酯各个含量按公式（1）计算，结果以μg/L表示。（前6个按内标1计算，后10个按内标2计算）
| $\rho = \frac{{{\rho _1} \times {V_1}}}{V}$ | (1) |
ρ为水样中各邻苯二甲酸酯化合物的质量浓度（μg/L）；ρ1相当于标准曲线的质量浓度（μg/L）；V1为样品定容体积（mL）；V为水样体积（mL）。
2 结 果 2.1 定性分析与定量离子选择（图1、表2）PAEs内标和外标进行GC-MS分析，根据PAEs标准色谱图与质谱图确定各物质保留时间、定量离子和定性离子。
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注：1. DMP，2. DEP，3. DIBP，4. DBP，5. DMEP，6. BMPP，7. DEEP，8. DPP，9. DHXP，10. BBP，11. DBEP，12. DCHP，13. DEHP，14. DPnP，15. DNOP，16. DNP。 图 1 PAEs混合标准溶液色谱图（2 000 μg/L） |
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表 2 16种邻苯二甲酸酯类化合物保留时间与监测离子 |
2.2 固相萃取柱选择
对HC-C18 glass，Supelclean ENVI-18、Welchrom C18E、Sep-Pak C18、HLB和Florisil PR萃取柱进行选择，活化柱子后，直接加入内标使用液4 μL，外标使用液50 μL，用10 mL二氯甲烷以2.0 mL/min洗脱，浓缩定容至1.0 mL，上机测定，外标单点法计算同位素内标与混标的绝对回收率，内标单点法计算混标的相对回收率（n = 2）。柱子选择原则如下：（1）同位素内标绝对回收率好；（2）本底干扰小，外标相对回收率好；（3）重现性稳定。
自动固相萃取仪与玻璃固相萃取内径不配套、密封性差，剔除HC-C18 glass。各萃取柱中内标D4-DBP与D4-DEHP绝对回收率（n = 2），HLB为24.5 % ～29.8 %，Florisil PR 46.1 % ～60.5 %，且两者洗脱液均混浊，因此排除HLB和Florisil PR。Supelco ENVI-18、Sep-Pak C18 和Welchrom C18E为72.5 % ～134.3 %。Supelco ENVI-18、Sep-Pak C18 和Welchrom C18E外标相对回收率比较：Sep-Pak C18中DBP达到439.2 % ～806.1 %；Welchrom C18E中DNOP为132.3 %，DNP146.2 %；而Supelco ENVI-18，除DMEP70.7 %，DEEP60.4 %，其余在82.5 %～112.6 %，且洗脱液澄清无杂质。综合考虑内标绝对回收率与本底干扰，选择Supelco ENVI 18萃取柱。
2.3 二氯甲烷的洗脱体积与洗脱速度Supelco ENVI 18固相萃取柱活化、加标（2.2），二氯甲烷溶液以2.0 mL/min的速度洗脱，以2 mL为一段，分段收集洗脱液。以体积V为横坐标，各段洗脱液中待测物峰面积A为纵坐标绘制回收曲线。10 mL时，16种待测物均充分洗脱。故洗脱体积定为10 mL。二氯甲烷10 mL分别以2.0, 5.0和10.0 mL/min的洗脱速度，洗脱加标萃取柱（n = 2），收集洗脱液浓缩定容至1 mL。以洗脱速度为横坐标，各待测物峰面积为纵坐标，比较不同洗脱速度的洗脱效果。大部分物质，洗脱效果无明显差别，但DBP随着洗脱速度的增加，其峰面积明显下降。所以选择洗脱速度为2.0 mL/min。
2.4 萃取柱氮吹萃取柱活化、加标（2.2），N2压力25 psi，吹干10 min，然后10 mL二氯甲烷2.0 mL/min速度洗脱，氮吹浓缩至1.0 mL，单点内标法定量。BMPP由97.0 % 降至66.9 % （n = 3），其余变化不大。说明氮吹对样品中目标化合物测定影响较小。
2.5 样品瓶吸附作用对6份透析水水样加标，加标浓度0.500 μg/L, 按1.5步骤处理，3份有二氯甲烷荡洗样品瓶步骤，另外3份无此步骤，上样分析，内标法定量。结果表明二氯甲烷荡洗后，内标D4-DBP绝对回收率差别不大，在84.4 % ～99.4 %，而D4-DEHP内标从18.2 % ～48.9 % 升至84.7 % ～94.2 %。待测物中BMPP的绝对回收率从22.4 % ～33.0 % 升至74.0 % ～78.3 %，DHXP从30.3 % ～50.2 %升至87.5 %～112.0 %，DNOP从22.7 % ～39 % 升至74.5 % ～96.1 %。同时由于内标D4-DEHP绝对回收率提高，DEEP相对回收率由166.0 % ～193.3 % 降至88.1 % ～116.5 %，其余无明显变化。因此为了消除样品瓶对待测物的吸附作用，样品瓶用二氯甲烷荡洗。
2.6 各试剂材料本底检测重蒸前后试剂PAEs本底，发现重蒸试剂后本底干扰有较大改善。本研究的分析物为环境污染物，所使用的试剂材料均存在本底干扰。同时各类水体均含有DIBP、DBP、DEHP等PAEs，会对样品特别是低浓度水平的样品产生影响。因此需重蒸试剂，并采取试剂空白、分析过程空白、水样空白等措施进行本底消除，以使实验结果更加准确、可靠。
2.7 标准曲线与方法检出限（表3）移取2.0 μg/mL混合标准使用液10 、50 、100、250、500和1 000 μL，加入内标使用液20 μL，正己烷定容至1.0 mL，配制成20～2 000 μg/L浓度标准曲线。平行进样（n = 2），计算同位素内标与各待测物峰面积。以各待测物系列浓度为横坐标x（μg/L），各组分与相应内标响应值比值为纵坐标y（As/Ai）绘制各组分的标准曲线。根据文献[9]，参考仪器检出限（instrument detection limit，IDL），以透析水为基质进行加标，浓度为0.020～0.030 μg/L，重复制备7个样品，计算多次测定结果的标准偏差s，代入公式MDL = st（n-1, 1-α）。其中：s为加标样品测试结果的标准偏差；t是自由度为n-1时的Student' s值，可查t值表得到，当n = 7时，在99 %置信区间（α = 0.01）下，t = 3.14；n = 加标样品数量，n ≥ 7。3倍MDL即为定量限（LOQ）。
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表 3 PAEs线性范围、回归方程、相关系数（r）、方法检出限（MDL）和定量限（LOQ）（n = 7） |
2.8 实际水样测定、方法准确度与精密度（表4，图2）
各种水体本底不同，分别对透析水（RO反渗）、闽江水（地表水源水）、管网末梢水（生活饮用水）、瓶装饮用水（地下水）等进行PAEs本底调查（n = 6），并进行低、中、高3种浓度水平的加标实验（n = 6），计算回收率与相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）。4类水体PAEs本底：透析水DIBP 0.089 μg/L、DBP 0.196 μg/L；闽江水含多种PAEs，以DEHP最高（0.246 μg/L），其余浓度0.025～0.201 μg/L；管网末梢水DIBP 0.112、DBP 0.843和DEHP 0.110 μg/L；瓶装饮用水DBP 0.151 μg/L和DEHP 0.115 μg/L。方法检出限为0.005～0.017 μg/L，方法定量限0.015～0.051 μg/L，回收率74.0 % ～118.4 %，RSD 1.1 % ～20.0 %，说明4类水体中PAEs的测定方法可靠，稳定。
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表 4 4种水样加标回收率和RSD（n = 6，%） |
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注：A透析水空白与加标；B闽江水空白与加标；C管网末梢水空白与加标。 图 2 各种水体的PAEs加标色谱图（加标浓度为0.500 μg/L） |
3 讨 论
世界卫生组织（World Health Organization, WHO）规定饮用水中DEHP的最大允许浓度为8 μg/L；美国环保局（United States Environment Protection Agency, USEPA）规定限值为6 μg/L；我国《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）DEHP、DEP和DBP的限值分别为8 μg/L、300 μg/L和3 μg/L。
国内外水体中PAEs以DBP、DEHP和DIBP为主。水源水国内[10]（DBP 0.08～9.8 μg/L，DEHP 0.05～12.6 μg/L和DIBP 0.196 μg/L）低于印度[11]与尼日利亚[12]（DBP 46.79～212.52 μg/L，DEHP 2.67～5.94 μg/L）。瓶装水国内[7]（DBP 164.51 μg/L，DEHP 129.17 μg/L和DIBP 309.29 μg/L）高于国外[13 – 15]（DBP 0.062～6.5 μg/L，DEHP 0.02～1.68 μg/L和DIBP 0.1～1.89 μg/L）。国内生活饮用水中[16 – 17]DBP（0.21～124.29 μg/L），DEHP（1.18～3.90 μg/L）和地下水[18 – 19]DBP（5.0～8.3 μg/L），DEHP（1.1～6.5 μg/L）。本研究4类水体PAEs也主要以DIBP、DBP和DEHP为主，且均处于较低水平（0.041～0.843 μg/L）。
PAEs检测方法目前有固相萃取–高效液相色谱法，MDL 0.18～1.86 μg/L[20]，固相萃取–超高效液质联用法，LOQ 0.002 μg/L～0.632 μg/L[21]，磁性多壁碳纳米管（MWCNTs）固相萃取–GC–MS法，MDL 0.04～0.47 μg/L[22 – 23]，固相萃取–GC–MS/MS法，MDL 0.007～0.012 μg/L[7]。上述方法均为手动固相萃取，上样量大、操作不便、重现性差，而自动固相萃取法仅见C18膜的全自动固相萃取– GC–MS法[24]，MDL 0.1～0.9 μg/L。本研究使用稳定性同位素内标–全自动固相萃取–GCMS法测定水中16种PAEs，MDL为0.005～0.017 μg/L，其准确度、精密度和自动化程度高，适用于水中PAEs的检测。
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