2018, Vol. 34
2. 辽宁省疾病预防控制中心;
3. 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)，在中国以前又称流行性出血热(epidemic hemorrhagic fever, EHF)是一种由汉坦病毒引起的重型患者病死率较高的常见急性传染病[1 – 2]。人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因是目前发现的与病毒性传染性疾病等多种疾病相关的人类最复杂的一种遗传多态性系统[3]。基于此，本研究收集2007 — 2016年辽宁省铁岭市辖区内医院收治的HFRS患者300例，采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-sequence specific primer，PCR-SSP)研究HLA-DRB 1、DQB1基因与HFRS的相关性，进一步探讨HFRS遗传相关性基因，旨在为HFRS免疫调控及免疫防治提供参考依据。现将结果报告如下。
1 对象与方法 1.1 对象选取2007 — 2016年辽宁省铁岭市辖区内医院收治的HFRS患者300例作为研究组研究对象，均符合全国肾综合征出血热监测方案2005年制定的诊断标准，经临床诊断及间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)法检测患者血清HFRS-IgG阳性，恢复期血清特异性IgG抗体比急性期增高4倍以上，白细胞计数可达(15～30)×10 9/L，血清中分离到汉坦病毒等确诊为HFRS患者，男性177例，女性123例；年龄18～80岁，平均年龄（46.62 ± 1.27）岁；病程（5.36 ± 1.32）年；另选取300名血清HFRS-IgG及IgM检测阴性的健康体检者为对照组，男性182名，女性118名，年龄18～79岁，平均（47.25 ± 1.25）岁。2组在年龄、性别等基本资料上相比差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
1.2 主要仪器及试剂DNA提取试剂盒（Dynal biotech公司）；Taq多聚酶（5 U/μL）（上海promego公司）；Pel-freezSSP Unitray试剂盒（Dynal biotech公司）；EC250–90 型电泳仪（英国AB gene公司）；PCR扩增仪（美国MJ公司）。
1.3 方法 1.3.1 基因组DNA提取取2组4 mL外周静脉血并加抗凝剂抗凝，采用改良快速盐析法按DNA提取试剂盒说明书操作将外周血淋巴细胞基因组中DNA提取出来。采用紫外分光光度计上进行DNA浓度及纯度的测定。
1.3.2 PCR-SSP基因分型对300例研究组和300名对照组的DNA标本用DQSSP UNITRAY、PEL–FREEZ HLA–DR试剂盒进行HLA–DRB1、DQB基因分型，根据2HLA–Ⅱ类等位基因核苷酸序列设计，PCR扩增参数如下:96 ℃预变性60 s；96 ℃变性25 s，70 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，循环5次；96 ℃变性25 s，65 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，循环21次；96 ℃变性25 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸120 s，循环4次。于含溴化乙锭的2 g/L琼脂糖凝胶中进行PCR扩增产物点样，连接电压120 V进行电泳，12 min后将琼脂糖凝胶置于紫外成像仪下观察并进行摄像保存，最后可根据Invitrogen公司提供的基因电泳格局图进行基因位点的确定。
1.3.3 观察指标基因频率 (gene frequencies，GF)：即指某个在基因座位上的等位基因与该基因座位上的全部基因的总数的比值，计算公式GF = X/2 n(n：该群体的人数，X：某等位基因在该群体中的个数)；相对危险率 (relative risk，RR)也叫率比或危险度比，是反映暴露与发病或死亡关联强度的指标，计算公式RR = (2a + 1)(2d + 1)/(2b + 1)(2c + 1)（式中a：群体中携带某一特定HLA基因型的患者人数；d：不携带某一特定HLA基因型的对照组人数；b：不携带某一特定HLA基因型的患者人数；c：携带某一特定HLA型别的对照组人数）。
1.4 统计分析采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析，其中比较计数资料采用χ2检验，采用Pearson线性相关分析法分析HLA-DRB1、DQB1基因多态性与HFRS相关性，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 2组HLA-DRB1等位基因GF比较（表1）研究组患者HLA-DRB1等位基因共可检测出12个基因位点，对照组HLA-DRB1等位基因共可检测出13个基因位点，且研究组HLA-DRB1*16 GF为8.0 %，明显高于对照组GF的1.0 %（RR = 6.60，χ2 =4.39，P < 0.05），2组其余HLA-DRB1等位基因GF差异无统计学意义（ P > 0.05）。
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表 1 2组HLA-DRB1等位基因GF比较 |
2.2 2组DQB1等位基因GF比较（表2）
2组DQB1等位基因均可检测出5个位点，研究组DQB1各等位基因与对照组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。
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表 2 2组DQB1等位基因GF比较 |
2.3 HLA-DRB1、DQB1基因多态性与HFRS相关性
Pearson线性相关分析结果显示，HLA-DRB1*16基因与HFRS呈正相关关系（β = 1.525，
HFRS在欧亚两洲的发病较多，而我国是受HFRS危害最为严重的国家，在同期世界总病例数中约占90 %，引起肾综合征出血热的汉坦病毒病毒是一种可感染人体多种脏器和器官的泛嗜性病毒，常常导致多脏器出现病理损伤及功能障碍[4]。目前，国内外已初步形成两大关于HFRS发病机制的学说，包括免疫致病和病毒致病，学说认为EHF发病的始动因素是病毒感染，可能导致细胞功能受到感染以及细胞结构受到损害，此外也使机体的免疫应答受到激发[5]。
HLA作为人体最复杂的遗传多态性系统具有参与抗原的处理与呈递的主要功能，其可活化T细胞参与免疫应答的遗传控制，并进行免疫调节[6 – 7]。因此，进一步对HFRS与HLA基因多态性的关联进行研究对揭示HFRS发病机制、机体受病毒侵入损伤的免疫及免疫应答机理具有十分重要的意义[8]。在不断深入筛选HFRS相关性基因及研究其功能的基础上，本研究采用分子生物学方法(PCR-SSP)对HFRS患者进行了HLA-DRB1、DQB1基因分型，研究发现研究组患者HLA-DRB1等位基因共可检测出12个基因位点，对照组HLA-DRB1等位基因共可检测出13个基因位点，且研究组HLA-DRB1*16 GF明显高于对照组GF，2组其余HLA-DRB1等位基因基因频率GF差异无统计学意义。研究组DQB1各等位基因与对照组相比差异无统计学意义。Pearson线性相关分析结果显示HLA-DRB1*16基因与HFRS呈正相关关系。这与冯继红等[9]研究结果一致, HLA-DRB1为EHF的易感基因，HLA-DQB1各高分辨等位基因是否与HFRS相关联尚需进一步研究。冯继红等[9]研究结果显示HLA-DRB1*16 GF与HFRS有关，对于HLA-DRB1*10没有足够的病例统计结果进一步说明，而本研究通过统计分析发现HLA-DRB1*10可能与[9]也存在相关性。在免疫反应的信号传导中HLA-DR和DQ分子起着重要作用，外源性抗原被HLA-DR和DQ分子呈递到T辅助细胞的T细胞受体，后B细胞表面抗原与这些细胞结合并受刺激而使B细胞增生，而HLA-DRB1和DQB1分别是DR和DQ分子的重要编码基因，对DR和DQ抗原多态性产生直接影响[10]。HLA-DRB1基因在HLA-II类基因中是决定DR抗原多态性的多态性最丰富的座位，而HLA-DQB1基因则对DQ抗原多态性起决定性作用，因此在免疫抗原多态性中HLA-DRB1和DQB1基因多态性是重要的组成部分，可能对多种疾病的发生产生一定影响[11]。HFRS是一种由汉坦病毒引起疾病，汉坦病毒侵入人体包括病毒抗原肽的识别、结合与加工、活化T细胞及释放细胞因子等免疫应答环节[12]。T细胞（抗原）受体（T cell receptor，TCR）识别病毒抗原肽时须对组织相容性复合体(human major histocompatibility complex, MHC)分子产生依赖，不同等位基因型的MHC分子对不同结构的肽抗原的结合能力有所不同，因此不同基因型的种系或人群抵抗病毒的能力也存在一定差异，部分可能会表现为易感[13]。由此可见，MHC作为高度多态基因区是一种可控制机体对抗原产生免疫应答的能力的连锁的免疫应答基因，MHC分子大多数的多态性残基均位于抗原结合凹槽内，而MHC结合抗原肽的能力是由位于MHC分子抗原结合部位中的氨基酸序列而决定的，而MHC的大部分多态性均出现在DRβ和DQβ链上，这两条链分别由DRB1和DQB1基因编码的，因此，DRB1、DQB1基因的多态性使病毒抗原与MHC-Ⅱ分子结合的能力受到影响，进而影响汉坦病毒侵入人体的免疫应答环节[14 – 15]。
综上所述，HLA-DRB1*16、HLA-DRB1*16基因与HFRS呈正相关关系，HLA-DRB1*16、HLA-DRB1*10基因可能是HFRS的易感基因之一，可能是HFRS发生中的危险因素
| [1] | LÜ Y, Sui F, Ma J, et al. Increased expression of EHF contributes to thyroid tumorigenesis through transcriptionally regulating HER2 and HER3[J]. Oncotarget, 2016, 7(36): 57978–57990. |
| [2] | 周价, 张潇, 陈梦施, 等. 洪灾区肾综合征出血热的流行病学研究[J]. 中南大学学报: 医学版, 2011, 36(3): 223–228. |
| [3] | 张世玲. 流行性出血热患者各期的病情观察及护理[J]. 中国医药指南, 2013, 11(13): 708–709. DOI:10.3969/j.issn.1671-8194.2013.13.568 |
| [4] | Nikbin B, Nicknam MH, Hadinedoushan H, et al. Human leukocyte antigen (HLA) class I and II polymorphism in Iranian healthy population from Yazd province[J]. Iran J Allergy Asthma Immunol, 2017, 16(1): 1–13. |
| [5] | 刘阿仲. 小儿流行性出血热11例治疗体会[J]. 中国临床研究, 2011, 24(11): 1021–1021. |
| [6] | Armstrong DL, Zidovetzki R, Alarcón-Riquelme ME, et al. GWAS identifies novel SLE susceptibility genes and explains the association of the HLA region[J]. Genes Immun, 2014, 15(6): 347–354. DOI:10.1038/gene.2014.23 |
| [7] | 吕凡彬, 张岩. HLA-Cw的免疫调节作用对肾移植受者长期存活的影响[J]. 中华移植杂志(电子版), 2012, 6(3): 31–35. |
| [8] | 储峰. 肾综合征出血热发病机制和早期诊断现状[J]. 世界感染杂志, 2011, 11(2): 81–83. |
| [9] | 冯继红, 孙万邦, 罗军敏, 等. HLA-DRB1、DQB1基因多态性与流行性出血热的相关性[J]. 山东医药, 2009, 49(48): 23–25. DOI:10.3969/j.issn.1002-266X.2009.48.009 |
| [10] | 张渊, 陈茹. HLA-DRB1和DQB1基因多态性与药物肝损害关联研究的meta分析[J]. 中华疾病控制杂志, 2012, 16(10): 833–838. |
| [11] | 崔雄鹰. HLA区域SNPs的检测及应用[J]. 分子诊断与治疗杂志, 2010, 2(3): 206–211. |
| [12] | 谭毅, 闭福银. 广西流行性出血热疫区类型及流行病学特征[J]. 应用预防医学, 2010, 16(3): 129–132. |
| [13] | 沈晗, 邵红伟, 黄树林. TCRαβ分子识别抗原肽-MHC复合物的争议问题探讨[J]. 中国免疫学杂志, 2013, 29(1): 93–96. |
| [14] | 富霄鹏. CD1蛋白家族及CD1蛋白和TCR相互作用的研究进展[J]. 中国免疫学杂志, 2017, 33(2): 308–312. |
| [15] | 罗晶, 李欣, 刘燕明. TCR信号与免疫应答/耐受的关系[J]. 免疫学杂志, 2011, 27(1): 86–89. |