持续性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染以血清学乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)检测结果可分为两类：HBsAg阳性(显性HBV感染)和阴性(隐匿性HBV感染，occult hepatitis B infection，OBI)^[1-3]。显性HBV感染的检测技术、临床治疗、流行病学等已相对阐明^[4-6]，但是对OBI的认识相对有限。OBI在全球范围内普遍存在，在一般人群感染率可与当地显性HBV感染相当^[7-8]。OBI的母婴传播已得到动物模型的证实^[9]，但是人群研究多为病例报告或小样本研究^[10-11]，缺乏足够证据明确群体影响。随着中国以及全球新生儿HBV疫苗免疫规划的实施，人群显性HBV感染比例已明显下降^[5]，然而OBI感染不能基于目前免疫策略而得到干预。因此OBI在孕妇群体的情况及对母婴传播的影响亟需明确。本研究以安徽省安庆市立医院为现场，建立住院孕妇前瞻性队列，收集孕妇基本资料，取血样进行病毒核酸抽提、巢式PCR和测序，以比较孕妇人群OBI和显性HBV感染比例、分布特征及其HBV序列变异规律。

以安徽省安庆市市立医院产科在2012年6月1日—2013年3月15日收治的所有住院孕妇为研究对象。纳入标准为所有进行首次基线调查的住院孕妇。排除标准：(1) 血液标本量不足；(2) 拒绝参加研究的孕妇。共纳入孕妇1 130人。

孕妇入院后，经知情同意(复旦大学伦理委员会批件，批件号：IRB#2013-03-0435)，进行住院孕妇登记，按常规进行产前检查，记录身高、体重、产次等信息，孕妇在治疗和/或分娩后的所有资料包括分娩方式、分娩状况、妊娠结局等，均摘自医院住院孕妇电子病历信息系统。所有孕妇的社会人口学记录均由专门的调查员定期从医院妇产科住院记录中摘录，以住院号为连接字段，与实验检测结果匹配。

孕妇入院后第2日抽取外周静脉血5 mL，置于灭菌Eppendorf管：室温静置约1 h后，以4 000 r/min离心15 min，吸取足量的上清液，双管分装(A管用于血清学检测，B管用于HBV S区巢式PCR检测)，于-80 ℃保存待检。对所有A管血清进行HBsAg检测(电化学发光法)，检测试剂采用罗氏诊断试剂公司出品的Elecsys系列试剂盒并使用Modular Analytics E170全自动电化学发光免疫分析仪(瑞士罗氏公司)进行自动化检测和分析。

对所有B管血清分别取200 μL，利用离心柱法手工抽提病毒DNA。抽提试剂采用天根生化科技(北京)有限公司生产的TIANamp Virus DNA/RNA Kit试剂(目录号：DP315)，严格按操作说明书进行。抽提的DNA立即用于后续实验或储存于-20 ℃备检。巢式PCR检测：方法与本课题组前期研究一致^[10]。目的片段为HBV基因组S片段的544个核苷酸(相当于GenBank中HBV标准株AB076679第223-766位核苷酸)。第1轮引物为S1(5′-CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3′，nt 56~75) 和S2(5′-ATACCC AAA GACAAAAGAAAA-3′，nt 827~807)，第2轮引物为S3(5′-GCGGGGTTTTTCTTGTTG AC-3′，nt 203~222) 和S4(5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3′，nt767~787)，所有引物均由上海华大基因生物工程公司合成。实验操作步骤简述如下：在0.2 mL的eppendorf管中，第1轮PCR依次加入引物S1/S2各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL, 模板DNA 2 μL，加ddH₂O至25 μL；第2轮PCR依次加入引物S3/S4各2 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，第1轮PCR产物4 μL，加ddH₂O至50 μL。扩增条件为：94 ℃变性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，第1轮、第2轮分别为35、25个循环。每次PCR均设阳性对照和阴性对照(ddH₂O)。PCR产物经琼脂凝胶电泳，若样品在根据marker判断靠近500 bp的位置有明亮条带，则认定该样品的S区PCR结果呈阳性，阳性结果需由不同人在不同实验室再次进行单独抽提核酸、PCR和电泳实验，再次实验结果为阳性者最终确认为阳性。

血清学检测HBsAg阳性即判定为显性HBV感染；HBsAg阴性而巢式PCR结果确认阳性者，为OBI；血清学与巢式PCR检测均阴性者为非HBV感染^[12]。所有确认阳性的PCR第2轮扩增产物(显性感染和OBI)均送上海华大基因生物工程公司进行双向测序。

根据得到的测序原始文件，采用MEGA 6.0软件对测得序列进行分析和拼接，获得HBV S基因核苷酸序列并进行进化分析。所用HBV标准株序列为：B基因型(AY206390、AY206391、AY800391、BX97850)；C基因型(AB033557、AB112063)。采用邻接法构建进化树，判断各样本HBV株基因型，并分别计算各位点核苷酸和氨基酸次要等位基因频率(minor allelic frequency, MAF)，按照文献[13]根据S基因核苷酸序列推导的第122位、127位、134位、159位、160位、177位及178位氨基酸确定其血清型。

采用SAS 9.3软件进行，2组均值和比例的比较分别使用t检验和Pearson χ²检验或Fisher精确概率法或Possion检验，所有P值均为双侧检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

本研究共纳入孕妇1 130人，年龄为17~41岁，平均年龄为(26.81±4.44) 岁; 以22~35岁为主，为966人，占85.8%。平均孕周为(35.75±7.08) 周，以30~40周为主，为897人，占79.4%。妊娠结局以活产为主，为1 019人，占90.2%；其余为流产及引产66人，占5.9%；死胎43人，占3.8%。孕妇绝大多数为汉族，为1 129人，占99.9%。主要来自安庆市及其市辖县，为1 026人，占90.8%。已婚1 022人，占90.5%。职业以无业为主，为453人，占40.1%；个体户106人，占9.4%。

表 1

表 1 显性HBV与OBI感染分布特征 人口学特征 显性HBV感染组 OBI组 χ2值 P值 检测数 阳性数 阳性率(%) 检测数 阳性数 阳性率(%) 年龄(岁)a 17~21 90 9 10.00 81 11 12.22 0.525 0.467 22~35 969 78 8.05 891 80 8.98 0.516 0.473 36~41 71 8 11.27 63 1 1.59 0.036b 来源地 安庆市区 485 35 7.22 450 47 10.44 3.040 0.081 安庆市辖县 541 50 9.24 491 35 7.13 1.522 0.217 其他 104 10 9.61 94 10 10.64 0.057 0.812 婚姻状况 未婚 107 12 11.21 95 18 18.95 2.379 0.123 已婚 1 023 83 8.11 940 74 7.87 0.039 0.844 孕周(周) ≤30 117 11 9.40 106 11 10.38 0.060 0.807 31~40 897 74 8.25 823 72 8.75 0.138 0.711 ＞40 116 10 8.62 106 9 8.49 0.001 0.972 职业 无业 453 37 8.17 416 32 7.69 0.067 0.796 农民 69 8 11.59 61 7 11.48 0.000 0.983 教师 52 1 1.92 51 6 11.76 0.060b 个体户 106 11 10.38 95 7 7.37 0.556 0.456 其他 450 38 8.44 412 40 9.71 0.418 0.518 注：显性HBV与OBI组比较，a P < 0.05；b Fisher精确概率法计算值。

表 1 显性HBV与OBI感染分布特征

1 130名孕妇中，HBV感染比例为16.55%(187/1 130)，显性HBV感染和OBI分别为95例和92例，占全部孕妇的比例分别为8.4%和8.1%。与显性HBV感染的孕妇相比，OBI孕妇年龄较低，差异有统计学意义(P < 0.05)；2组孕妇的来源地、婚姻状况、孕周、职业分布差异均无统计学意义，2组孕妇的身高、体重、体质指数及妊娠结局差异均有统计学意义。

图 1

注：●隐匿性HBV病毒株；○显性HBV病毒株。 图 1 显性和隐匿性HBV病毒株S基因目的片段分子进化树

本研究共获得HBV S基因序列136株，其中92株来自OBI孕妇，44株来自显性HBV感染孕妇(自95例显性HBV感染的孕妇中分离获得)。所有136株HBV株中，17株为基因C型(12株OBI，5株显性HBV)，血清型全部为adr；119株为基因B型(80株OBI，39株显性HBV)，血清型为87株adw2、29株adw3和3株无法定型。OBI和显性HBV株的基因型/血清型分布差异无统计学意义。特别地，本研究发现有1簇基因B型(图 1，虚线椭圆形标识)全部由OBI株组成。

表 2

表 2 基因B型显性和隐匿性HBV S区序列核苷酸和氨基酸替换 核苷酸替换 氨基酸替换 隐匿株(n=80) 显性株(n=39) MAF%比值：隐匿株/显性株 S片段 P片段 替换位点数 MAF% 替换位点数 MAF% G285A G44E G399G 36 45.0 2 5.1 8.8 C400A I82I I438L 33 41.3 1 2.6 16.1 A520G L122L K478N/D 35 43.8 1 2.6 17.1 A530G T126A N481S/D 21 26.3 2 5.1 5.1 A540G R129Q S484S 2 2.5 5 12.8 0.2 G621T W156L L511F 33 41.3 0 0.0 ∞ C724T V190V L546L 34 42.5 1 2.6 16.6 T753A Y200F V555V 40 50.0 3 7.7 6.5

表 2 基因B型显性和隐匿性HBV S区序列核苷酸和氨基酸替换

因基因C型HBV株过少，以下重点分析119株基因B型HBV株的序列变异规律。与显性HBV株比较，OBI株具有更高的总体核苷酸和氨基酸位点替换率：显性[核苷酸：4.3‰，91/(39×544)，氨基酸：7.5‰，53/(39×181)]；OBI[核苷酸：8.3‰，360/(80×544)，氨基酸：13.7‰，199/(80×181)](Possion检验，P < 0.05)。比较OBI株与显性株，S基因核苷酸上有8个位点出现统计显著的替换，其中3个位点(C400A、A520G和C724T)OBI株的最小等位基因频率(minor allellic frequencies，MAF)比值是显性HBV株的 > 16倍，并且G621T仅在隐匿性HBV出现，而显性HBV株未出现，提示OBI株和显性株可能可以从核苷酸水平加以区分，有一定的临床诊断价值。这8个位点替换导致相应的S基因氨基酸序列出现3个同义替换(I82I、L122L和V190V)和5个统计学显著差异的非同义替换(G44E、T126A、R129Q、W156L和Y200F)，以及P基因氨基酸序列出现4个同义替换(G399G、S484S、L546L和V555V)和4个统计学显著差异的非同义替换(I438L、K478N/D、N481S/D和L511F)。此外，本研究发现3例和1例隐匿性HBV株分别发生W135终止码替换、第123和124位之间出现2个氨基酸(KN)的插入突变。

本研究结果表明，住院孕妇具有较高的HBV感染比例，其中显性HBV感染和OBI大致相当；比较显性和隐匿性B基因型HBV株序列后，识别了8个有差异的核苷酸位点替换，其中7个导致HBV S基因和/或P基因出现非同义氨基酸替换，4个具有较高的MAF比值。

在1 130名孕妇中，显性HBV感染和OBI比例分别为8.4%和8.1%。孕妇较高的显性HBV感染比例或与研究采用的检测方法、当地乙肝的流行情况和防治策略等因素有关。本研究采用电化学发光检测方法筛查HBsAg，其灵敏度高于常规乙肝两对半ELISA检测试剂盒^[14]；2006年全国人群乙肝血清流行病学调查结果显示，15~59岁人群HBsAg携带率为8.57%，安徽省安庆市位于我国中部地区，乙肝流行程度介于东西部地区之间，近年研究报道25~30岁人群HBsAg阳性率为9.2%^[15]；本研究孕妇有85.8%年龄 > 22岁，这些孕妇在出生时(即早于1992年)我国未将HBV疫苗纳入计划免疫管理，< 22岁的孕妇(1992—2002年出生)需自愿自费接种HBV疫苗^[16]，因此该地区孕妇人群HBV疫苗接种率较低(15~59岁人群仅14.35%^[15])。上述因素可能是本研究中孕妇较高显性感染比例的原因。而在HBsAg阴性孕妇人群中仍有高达8.2%的OBI比例，与显性感染比例相当，提示该地区孕妇OBI不容忽视。迄今，国内外文献报道的孕妇OBI比例波动在0.0%~23.5%(按从低到高：巴西0.0%^[17]、德国0.99%^[18]、加纳1.46%^[19]、南非1.7%^[20]、突尼斯4%^[21]、中国深圳5.7%^[22]、中国浙江10.2%^[10]、韩国11.39%^[23]、泰国23.5%^[24])，这些研究人群人口学特征[是否乙肝流行区、乙肝核心抗体阳性、艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)阳性等]、HBsAg筛查和HBV DNA检测方法、以及对OBI的定义不尽相同，因此结果无法直接比较。与国内同类研究报告的OBI比例(5.7%~10.2%)^[10,22]相比，本研究结果处于中等水平。在技术方法方面，本研究经高灵敏度筛查HBsAg排除显性HBV感染孕妇人群，采用巢式PCR检测HBV DNA，灵敏度高，同时双遍确认检测保证了OBI识别的可靠性；本研究仅扩增HBV S基因，根据单一片段判断OBI，可能导致获得的OBI比例偏高，使用相似方法的研究报道的OBI比例也处于较高水平^[10,23]。

OBI的发生机制尚不清楚。人群感染HBV后，无论是急性感染的痊愈或慢性持续性感染，乙肝cccDNA均可长期在肝脏中持续存在^[1]。人体的免疫监控，可有效抑制HBV复制^[25]。孕妇在怀孕期间，为了不排斥胎儿的外来抗原，孕妇始终处于一定的免疫抑制状态，尤其是细胞免疫^[26]。因此，孕期的免疫状况可能有利于HBV的复制。而HBV DNA复制的逆转录过程缺乏错误修正机制，变异发生率相对较高^[27]；如发生在HBV中和表位，即S区的变异，则往往导致病毒的复制、释放等出现问题，HBsAg表达障碍或HBsAg发生表位改变导致其与抗体的亲和力下降或消失^[28]，从而影响现有常规HBsAg筛查试剂的识别而出现检测逃避^[29-32]。各种内源因素(如宿主免疫应答、HBV变异株的复制适应力和复制空间)以及外源因素(抗病毒和免疫类药物以及乙肝疫苗免疫接种的使用情况)的双重影响，使得HBV种群演变有其固有的、复杂的进化特征。

既往研究表明，与显性HBV相比，OBI株中C基因型的比例更高^[10,33-34]，而本研究发现孕妇人群主要HBV流行株为B基因型/ adw2血清型，其分布在显性和隐匿性HBV株并无不同，此结果是否与孕妇特殊的生理与免疫状态以及当地HBV流行特征等有关，需要进一步研究。对基因B型HBV株的分析发现，隐匿性HBV株比显性HBV株具有更高的核苷酸和氨基酸位点替换率，以及拥有8个有统计学差异的位点核苷酸替换。这些核苷酸替换影响着相应氨基酸的变异：HBV S区“a”抗原决定簇(aa124-147) 出现T126A和R129Q替换，与其他研究类似^[31]，此类变异常常导致检测逃避。而位于“a”抗原决定簇外的3个位点替换-G44E、W156L和Y200F，其生物学功能尚不清楚；目前同类研究未有报道这3个位点变异，而有研究表明，这类替换可能影响病毒复制或调节基因，从而影响HBsAg表达和分泌的调节过程^[28,35]，也有可能与HBsAg的血清学转换有关，影响与抗-HBs的结合作用^[35]。由于HBV ORFs的折叠特征，这些核苷酸替换相应地导致HBV P区基因出现4个非同义替换(I438L、K478N/D、N481S/D和L511F)，可能影响逆转录酶影响HBV DNA的复制过程^[36]，还可影响糖皮质激素应答元件(glucocorticoid responsive element，GRE)的功能从而降低HBV复制^[37]，目前关于OBI在这些位点变异的研究较少。此外，1例B基因型OBI的病毒株在第123与124位氨基酸之间发生氨基酸K和N的插入突变，此突变有可能协同引起N146糖基化位点突变，减少HBV分泌，进而容易导致免疫逃避^[38]。而3例B基因型OBI病毒株在第35位发生氨基酸W到终止码的突变使得HBsAg无法正常表达。有报道OBI人群在S区发生插入和终止突变，但是发生例数较少^[39]，这类突变对OBI发生机制和传播的影响有待进一步研究。

OBI突出的特征是其隐匿性，这类感染者无法被基于“a”抗原决定簇而建立的现有HBsAg检测技术所识别，而出现检测逃避^[28]，因此需要发展合适的检测手段予以识别。HBV出现的非同义替换，主要影响着HBV的结构和功能；而本研究发现引起HBV S基因出现同义替换的核苷酸位点，如C400A、A520G和C724T，OBI株与显性HBV株在这些位点的MAF比值可高达16~17，而A540G位点仅仅出现在隐匿性HBV株中，提示针对这些位点研制OBI识别方法的可能性。此外，我们还发现了一簇全部有隐匿性HBV株组成的基因B型亚群，尚不清楚其发生原因及其可能影响。

母婴传播是显性HBV感染的主要途径^[26]。现有新生儿乙肝免疫球蛋白结合疫苗免疫策略可阻断约90%的HBV母婴传播^[6]，但有研究发现，显性HBV感染的孕妇在采取该策略后有约43%的婴儿在2岁时仍具有OBI^[40]；土拨鼠实验模型和人群研究也支持OBI可从显性HBV感染和OBI经过垂直传播和水平传播等途径而获得^[9,11]；而OBI孕妇与非乙肝感染孕妇，其新生儿采取相同的免疫策略，忽略了这方面OBI母婴传播的干预。目前文献报道的乙肝疫苗免疫接种人群OBI比例波动在0.0%~64%^{[10,34,40-48]}，也提示着其可能的传染来源主要来自于其母亲。本研究发现孕妇人群OBI株相比显性HBV株存在“a”抗原决定簇变异，可能会引起新生儿HBV疫苗免疫失败^[49]以及产生OBI，在人群中发生静默传播，提示应重视孕妇OBI的母婴传播研究、预防与控制。至于母婴传播的识别，需要后续结合母婴配对样本研究来验证。

本研究发现孕妇人群存在较高的HBV感染比例，OBI与显性HBV感染比例大致相当。识别了8个有助于区分基因B型的OBI和显性HBV感染的核苷酸位点替换，导致HBV S基因和/或P基因出现非同义氨基酸替换，提示这些替换可能与OBI的发生机制有关，并可能影响现有乙肝免疫策略效果。应结合OBI，重新评估孕妇乙肝感染的筛查和现有乙肝免疫策略在阻断母婴传播的效果以及研制OBI识别方法的紧迫性。

本研究的不足之处是未能测定HBV感染孕妇的病毒载量、相对较少的基因C型HBV株，无法了解这两者在显性HBV感染和OBI之间的差异，以及缺少婴儿配对标本测定，无法确定OBI株的母婴传播具体情况。后续研究应招募更多的孕妇人群，并结合新生儿出生队列，从而更为全面地了解OBI对母婴传播及其乙肝疫苗防治效果的影响。