2017, Vol. 33
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，是由遗传、免疫、环境和饮食等多方面作用而引起的慢性疾病。其发病机制主要是遗传易感个体肠道共生菌群的宿主免疫应答失调[1]。近年来，UC的发病率逐年上升，严重影响人们的健康。研究表明UC会增加结肠癌的发病风险[2]。流行病学数据显示遗传变异不能完全解释疾病的发病率，表明饮食因素和环境因素等对UC、结肠癌具有重要作用。在IBD成年患者中，近50%患者存在维生素D(vitamin D，VD)缺乏，约11%的患者有严重VD缺乏[5]。研究表明每天多摄入100 IU VD，患UC的风险会下降10%[6]。近年来研究发现VD缺乏与各种自身免疫性疾病的发生、发展有关[7]。VD3代谢途径涉及多种酶反应，大多数VD3由VD结合蛋白或脂蛋白携带到肝脏，在肝脏中经肝细胞25-羟化酶作用生成25-(OH)D3，经肾脏线粒体内1-α羟化酶的作用生成VD的活性形式1, 25-(OH)2D3，发挥生理功能[8]。抗坏血酸(ascorbic acid，AA)是羟化酶的辅助因子，VD3发挥生理功能需要经2次羟化后转化为1, 25-(OH)2D3，羟化酶的激活又需要羟化酶辅助因子AA参与，Cantatore等[9]研究发现，55~71岁女性每日补充150 mg AA，连续补充10 d，血清1, 25-(OH)2D3升高，表明AA在VD3转化为其活性形式的过程中起着重要作用。本文旨在探讨联合应用AA和VD3对豚鼠体内1, 25-(OH)2D3水平和UC的影响。结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器维生素D3、抗坏血酸(北京索莱宝公司)；抗坏血酸标准品(美国Sigma公司)；葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)(美国MP Biomedicals公司)；25-羟基维生素D3[25-(OH)D3]、1, 25-二羟基维生素D3[25-(OH)2D3]、细胞色素2R1(CYP2R1)、细胞色素27B1(CYP27B1)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6) 和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)试剂盒(上海BIO SWAMP公司)。酶标仪(美国Bio-Rad公司)；高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；高速台式离心机(德国Eppendorf公司)。
1.2 实验动物与分组32只健康雄性Dunkin-Hartley豚鼠，体重(350 ± 20) g，由北京海淀兴旺实验动物养殖场提供，生产许可证号：SCKY(京)2011-0010。适应性喂养2 W后，随机分为4组，即对照组(120 mg AA+2.8 μg VD3/kg)、模型组(120 mg AA+2.8 μg VD3/kg)、高剂量AA组(240 mg AA+2.8 μg VD3/kg)和低剂量AA组(8 mg AA+2.8 μgVD3/kg)，每组8只。将1 mg VD3溶于1 mL无水乙醇中作为母液，采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)逐级梯度稀释，AA用蒸馏水稀释。采用改良的豚鼠灌胃方法[10]分别灌胃给予AA和VD3溶液，连续7W；除对照组豚鼠饮用蒸馏水外，模型组、高、低剂量AA组豚鼠均自由饮用含3%DSS蒸馏水，造模期间AA和VD3的灌胃剂量不变，连续3 d。采用3%戊巴比妥钠麻醉豚鼠，剖开胸腔，心脏采血3~5 mL，3 000 r/min离心10 min，分离血清；分离结肠、肝脏、肾脏，-80 ℃冻存待测。
1.3 指标与方法 1.3.1 结肠病变评分将结肠沿肠系膜纵轴剪开，用生理盐水清洗内容物后，进行肉眼大体形态评分；根据体重下降率、大便性状和肉眼血便进行疾病活动指数评分(disease activity index，DAI)；取病变部位结肠组织，用10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，苏木素-伊红染色(hematoxylin eosin，HE)，显微镜下观察，进行组织病理学评分[11]。
1.3.2 血清中抗坏血酸含量检测采用高效液相色谱-紫外检测法，流动相为30 mmol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇(体积比88:12)，pH 3.0，流速0.8 mL/min，检测波长243 nm，柱温35 ℃，手动进样，进样量20 μL；血清样品的前处理参考文献[12]方法，准确称取10 mg AA，将其溶于10 mL纯水中，逐级梯度稀释，标准品浓度依次为0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0和10.000 0 μg/mL。
1.3.3 血清中25-(OH)D3、1, 25-(OH)2D3含量检测采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，样品加入量10 μL，酶标仪比色波长450 nm，按照试剂盒说明书操作。
1.3.4 血清中IL-6、TNF-α水平检测采用ELISA法，样品加入量10 μL，酶标仪比色波长450 nm，按照试剂盒说明书操作。
1.3.5 肝脏CYP2R1和肾脏CYP27B1表达水平检测肝脏和肾脏组织各取1~2 g，加入组织重量9倍的PBS，匀浆后3 000 r/min离心10 min，取上清，检测肝脏CYP2R1和肾脏CYP27B1表达量，按照试剂盒说明书操作。
1.4 统计分析数据用表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，检验水准为α=0.05。
2 结果 2.1 豚鼠UC模型建立造模第2天，模型组豚鼠进食量明显减少，体重下降，精神萎靡，目光呆滞，被毛杂乱，部分豚鼠出现弓背、腹泻、粘液便、血便等现象；造模第3天，豚鼠普遍出现粘液便、血便，提示，豚鼠UC模型造模成功。
2.2 AA联合VD3对豚鼠UC严重程度影响(表 1、图 1)
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表 1 AA联合VD3对豚鼠UC严重程度影响(分，x±s，n=8) |
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注：A：对照组；B：模型组；C：高剂量AA组；D：低剂量AA组。 图 1 VD3联合AA对豚鼠UC严重程度影响(HE，×400) |
与对照组比较，模型组结肠DAI评分、大体形态评分和组织病理学评分升高；与模型组比较，低剂量AA组豚鼠结肠DAI评分和大体形态评分升高；与低剂量AA组比较，高剂量AA组豚鼠结肠DAI评分和大体形态评分下降，差异均有统计学意义(P < 0.05)。
2.3 AA联合VD3对豚鼠血清中25-(OH)D3及1, 25-(OH)2D3水平影响(表 2)与对照组比较，模型组豚鼠血清中25-(OH)D3、1, 25-(OH)2D3水平降低；与模型组比较，低剂量AA组团血清中25-(OH)D3水平降低；与低剂量AA组比较，高剂量AA组豚鼠血清中25-(OH)D3、1, 25-(OH)2D3水平升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)。各组豚鼠血清中AA含量无明显差异。
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表 2 AA联合VD3对豚鼠血清中25-(OH)D3、1, 25-(OH)2D3和AA水平影响( , n=8) |
2.4 AA联合VD3对豚鼠肝脏CYP2R1和肾脏CYP27B1表达影响(表 3)
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表 3 AA联合VD3对豚鼠肝脏中CYP2R1和肾脏中CYP27B1表达影响(ng/mL，x±s，n=8) |
与对照组比较，模型组豚鼠肝脏CYP2R1和肾脏CYP27B1表达降低(P < 0.05)；与低剂量AA组比较，高剂量AA组肝脏CYP2R1和肾脏CYP27B1表达升高(P < 0.05)。
2.5 AA联合VD3对豚鼠血清IL-6和TNF-α水平影响(表 4)|
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表 4 AA联合VD3对豚鼠血清中IL-6和TNF-α水平影响(ng/mL，x±s，n=8) |
与对照组比较，模型组豚鼠血清中IL-6和TNF-α水平升高；与模型组比较，低剂量AA组豚鼠血清中IL-6和TNF-α水平升高；与低剂量AA组比较，高剂量AA组豚鼠血清中IL-6和TNF-α水平降低，差异均有统计学意义(P < 0.05)。
3 讨论1, 25-(OH)2D3是VD发挥生理功能的活性形式，在固有免疫应答和适应性免疫应答过程中发挥重要作用。VD活化为1, 25-(OH)2D3需要经过2次羟化，其中CYP2R1、CYP27A1、CYP3A4和CYP2J3是VD-25-羟化酶，参与VD的第一步羟化；CYP27B1和CYP24A1是25-(OH)D-1α-羟化酶，参与VD的第二步羟化，CYP27B1负责完成激素形式1, 25-(OH)2D3的激活，CYP24A1负责1, 25-(OH)2D3的分解[13]。研究表明CYP27B1活性升高，CYP24A1活性降低，能使组织中1, 25-(OH)2D3水平升高[14]。主要的VD-25-羟化酶可能是CYP2R1和CYP27A1，CYP2R1具有VD高亲和力[15]。CYP27B1是线粒体细胞色素P450催化VD激活的最后一步[16]，25-(OH)D3活化为1, 25-(OH)2D3的过程中必须有CYP27B1参与[8]。AA是羟化酶的辅助因子，VD在活化为1, 25-(OH)2D3的过程中需要羟化酶参与，羟化酶激活又需要羟化酶辅助因子AA参与。本研究结果显示，低剂量AA组豚鼠肝脏CYP2R1和肾脏CYP27B1水平低于模型组，高剂量AA组高于低剂量AA组比较。提示，AA参与了肝脏CYP2R1和肾脏CYP27B1的激活和VD的活化。
IL-6在实验性结肠炎、结肠癌和肿瘤发生中具有重要作用[17]。TNF-α是一种促炎性细胞因子，对多种细胞类型具有生物学效应，在多种慢性炎症性疾病的发病机制中起着决定性作用[18]。研究表明1, 25-(OH)2D3能够抑制人类单核细胞产生炎性细胞因子IL-6和TNF-α[19]，1, 25-(OH)2D3能够改善DSS诱导的动物实验性UC。本研究结果表明在适宜范围内AA水平越高，豚鼠血清中1, 25-(OH)2D3含量越高，结肠DAI评分、大体形态评分、组织病理学评分、血清IL-6和TNF-α的水平越低。提示，AA可能参与VD3活化，AA与VD3联合应用能够缓解豚鼠UC炎症程度。
本研究采用豚鼠UC模型主要是考虑到豚鼠与人体自身均不能合成AA，依赖于食物的摄入[21]，采用豚鼠作为动物模型能够更加真实地模拟人体状态。本研究对UC模型豚鼠进行AA和VD3的联合干预，克服了单一营养素的不足和目前临床药物干预的缺陷；本研究采用改良的豚鼠灌胃方法进行干预，既避免了对豚鼠食道的损伤，又克服了因进食饲料量不同而导致摄入的干预物剂量不准确的缺点，能够更加真实地反应AA和VD3联合应用对豚鼠UC的影响。但AA在多大程度上参与了VD3的活化，1, 25-(OH)2D3在多大程度上影响到UC的发生发展，尚需进一步研究证实。
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