2017, Vol. 33
2. 南方医科大学中医药学院;
3. 深圳罗湖区疾病预防与控制中心;
4. 南方医院感染内科
香港海鸥菌 (Laribacter hongkongensis, LH)，于2001年在香港一名肝硬化病人的胸腔脓血中分离到并被鉴定为变形菌门 (Proteobaxteria)、β-变形菌纲 (β-subclass Proteobacteria)、奈瑟菌科 (Neisseriaceae) 的一个新属[1]。随着对该菌研究的进一步研究发现，香港海鸥菌不仅可引起人类胃肠炎，还可能是菌血症或腹膜炎的病原菌之一[2]。但总体而言，对于该新发现细菌的研究仍处于初级阶段。而关于香港海鸥菌适宜保存方法的研究，尚无相关报道。简单又有效的保存菌种，是细菌学研究中最基础的实验室工作。目前，微生物菌种保存方法主要有斜面保存法、石蜡油封存保存法、真空冷冻干燥法及甘油低温保存法等[3]。其中以真空冷冻干燥法最佳，但因其需要特定的设备，较难在一般实验室普及。为确定一种经济、简便和保存效果好的香港海鸥菌的保存方法，本研究选取5种实验室常用的菌株保存方法进行比较。现将结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要培养基与试剂麦康凯琼脂 (MacCon Agar, MacCA)、营养琼脂、半固体培养基、Luria-Bertani (LB) 增菌肉汤 (广州环凯微生物科技有限公司)；液体石蜡、三糖铁琼脂、脲酶及精氨酸双水解酶生化管 (北京路桥有限公司)；氧化酶试纸、触酶 (英国Oxiod公司)；磁株菌种保存管 (北京友康恒业生物科技有限公司)。
1.2 菌株实验用香港海鸥菌HLHK9由香港大学袁国勇教授馈赠。该菌株分离自香港一名患有严重腹泻并伴有呕吐和腹痛的病人的粪便标本中，具有香港海鸥菌典型的形态结构和生化特性，其全基因组序列已公布 (GenBank登录号:NR_074669)，为研究香港海鸥菌常用的模式菌株[4]。
1.3 菌株纯化培养无菌条件下，将HLHK9划线接种于麦康凯琼脂平板，置于37 ℃恒温培养48 h。挑取单个典型菌落 (直径在1.5~2.0 mm之间，浅灰色、半透明圆形、中间略凸起、光滑)，接种于营养琼脂平板分纯培养 (37 ℃，24 h)；另挑取单个典型菌落于LB肉汤中增菌培养 (37 ℃，200 rpm/min) 直至菌液optical density (OD)600nm达到1.0。
1.4 保存方法 1.4.1 半固体石蜡封存法保存管制备:无菌条件下，将灭菌好的半固体琼脂培养基分装于2 mL灭菌冻存管中 (每管1 mL)，待冷却凝固后置于4 ℃冰箱中备用。保菌:无菌条件下，用接种针挑取营养琼脂上单个新鲜香港海鸥菌菌落穿刺接种于半固体琼脂中，半拧紧管盖，并置于37 ℃培养箱培养24 h，后向保存管内缓慢加入400 μL灭菌液体石蜡，拧紧管盖，分置于室温环境和4 ℃冰箱中保存。
1.4.2 磁株菌种保存管无菌条件下，用一次性无菌接种环挑取营养琼脂上新鲜的香港海鸥菌菌落，接种于磁株保存管中。拧紧瓶盖，来回颠倒使菌乳化，配成大约3~4麦氏比浊度的菌悬液。用一次性无菌枪头尽可能吸干溶液并立即放入-20 ℃和-80 ℃冰箱中保存。
1.4.3 10%甘油无菌条件下，用无菌枪头吸取LB肉汤培养的香港海鸥菌新鲜菌液 (OD600nm=1)，转移至1.8 mL的无菌EP管 (eppendorf tube) 中，8 000 rpm/min离心5 min，吸尽上清，加入300 μL的10%甘油重悬细菌，分置于-20 ℃和-80 ℃冰箱中保存。
1.4.4 15%甘油肉汤无菌条件下，用无菌枪头分别吸取500 μL香港海鸥菌的新鲜菌液 (OD600nm=1) 及500 μL30%甘油于EP管中，混匀。甘油在混合物中的最终浓度为15%。分置于-20 ℃和-80 ℃冰箱中保存。
1.4.5 30%甘油肉汤方法及步骤同1.4.4所述，不同的是使用的甘油浓度为60%甘油，最终甘油在混合物的浓度为30%。
以上5种保存方法中:磁珠菌种保存管保存10管，其余方法各保存200管。半固体石蜡封存法保存的菌种各100管置于室温环境和4 ℃冰箱中保存，其余4种方法各100管置于-20 ℃和-80 ℃冰箱中保存。
1.5 菌种复苏 1.5.1 复苏时间每次复苏时不同保存方法和存放温度各复苏2管，1个月复苏1次，连续试验12个月。
1.5.2 具体步骤半固体石蜡封存法：无菌条件下，用无菌枪头吸尽半固体琼脂上层石蜡，将管内容物全部转移至9 mL LB肉汤试管中混匀。磁珠保存法：无菌条件下，用无菌一次性接种环挑取一颗磁珠转至含1 mL LB肉汤的EP管中，漩涡振荡15 s。甘油保存法：取出菌种管至完全融化后混匀，无菌条件下，用无菌枪头吸取100 μL菌液混合物转移至含900 μL LB肉汤的EP管中，混匀。经上述处理，获得各方法稀释10倍后的菌液，再以10倍梯度稀释菌液。保菌后第一天复苏的稀释倍数根据预实验确定，保存特定时间后的复苏稀释倍数根据上一次活菌计数的结果做适当的调整。最后，分别吸取100 μL稀释10n倍及10n-1倍 (10n表示最高稀释倍数) 的稀释菌液至标准大小 (90 mm) 的MacCA平板中，用灭菌玻璃棒均匀涂布整个平板，后置于37 ℃恒温培养48 h。每个稀释度涂布3个平板。
1.6 平板菌落计数和生物学特性检测MacCA平板培养48 h后，计数每个平板上的菌落数。计数时选取菌落数在25~250之间的平板。以各平板的菌落总数，得出同一稀释度的平均菌落数 (colony forming unit, CFU)，后计算每mL或每颗磁珠的菌落数。同时观察菌落形态，并进行脲酶、三糖铁和精氨酸双水解酶试验。
2 结果 2.1 菌落计数 (图 1、2)
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图 1 香港海鸥菌在半固体石蜡封存中的保存效果 |
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图 2 磁珠、10%甘油、15%甘油肉汤及30%肉汤在-80 ℃保存香港海鸥菌的效果 |
半固体石蜡封存法：室温条件下保存的菌种，活菌菌落数在6个月内呈缓慢下降趋势 (菌落数的对数值变化 < 1)；6个月后，活菌数快速下降，至第9个月时菌落数为0 CFU/mL。而4 ℃保存的菌株，在第1个月活菌数下降幅度小，1个月后迅速下降，到第2个月时菌落数为36 CFU/mL, 到第3个月时为0 CFU/mL (见图 1)。磁珠、10%甘油、15%甘油肉汤和30%甘油肉汤保存法:在-80 ℃条件下，活菌计数在第1个月下降比较明显 (菌落数的对数值下降>1)，但1年内活菌计数整体呈缓慢下降趋势或基本保持稳定 (见图 2)。在-20 ℃条件下保存1个月后，与-80 ℃有相同稀释倍数的菌落均无生长。为更好掌握香港海鸥菌在-20 ℃条件下保存的变化情况，采用30%甘油肉汤再次保菌并置于-20 ℃保存，缩短复苏间隔及调整稀释倍数。菌液在冷冻前的菌落计数为1.3×109 CFU/mL，在保存15 d、1个月、2个月的菌落计数分别为1.5×106 CFU/mL、1.5×104 CFU/mL、0 CFU/mL。
2.2 形态特征与生物学性状 (图 3)
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注：左侧为磁珠在-80 ℃下保存7个月时复苏时的菌落大小 (直径在1.0~1.5 mm)；右侧为半固体石蜡封存法室温下保存7个月时复苏的菌落大小 (变小，甚至呈针尖样)。 图 3 37 ℃培养48 h后，香港海鸥菌生长在麦康凯琼脂平板上的菌落形态 |
半固体石蜡室温保存7个月后，生长在MacCA平板上的菌落变小，难以从形态大小上辨认出来 (图 3右)，但其生化特征未改变。其余4种方法在-80 ℃保存12个月后，菌落的形态特征和生化特性均未发生改变。
3 讨论菌落形成单位 (CFU) 与一般的计数方式相比，只计算活的菌落，结果可靠；而后者直接在显微镜下计算全部细菌[5]。此外，香港海鸥菌在MacCA平板上的形态为单个孤立的菌落，非链状或团块[6-7]，故本研究应用CFU计数来评价各方法保存香港海鸥菌的效果。
本研究结果提示，半固体石蜡封存法 (室温) 比较适合短期保存香港海鸥菌。此保存方法的优点为操作简单、不需特殊设备。但不足之处为必须直立存放，不便携带[8-9]；且不合适较长时间 (>6个月) 保存香港海鸥菌，因保存时间超7个月后，菌落形态变小，肉眼难以辨认。此外，在-80 ℃条件下，磁珠与不同甘油浓度保存的菌种，其菌落数呈缓慢下降或保持相对稳定，而在-20 ℃条件下保存时间短、效果差，提示磁株或甘油的低温保存 (-80 ℃) 较为适合香港海鸥菌的长期保存。通过比较上述5种方法发现，同一温度下，不同方法保存的菌种的活菌数变化趋势基本一致，但同种方法在不同温度条件下活菌数变化明显，提示温度可能是影响香港海鸥菌保存效果的主要因素，这与空肠弯曲菌的保存结果较为一致[10]。故采用磁珠或甘油保存法并置于-80℃条件下可长期保存香港海鸥菌；而采用半固体石蜡封存法并置于室温条件下可短期保存，但半年需传代一次。
此外，在本次研究中，用磁珠保存的菌种，每次复苏是从相应条件下 (-80 ℃或者-20 ℃) 取同一磁珠菌种保存管，挑取其中一颗磁珠后立刻放入原处，存在菌管反复冻融的可能；而甘油保存的菌种，每次随机抽取两管进行复苏与计数，只复苏一次，不存在反复冻融问题。与甘油保存法相比，磁珠保存的菌落计数呈缓慢下降趋势，可能与反复冻融有关。同时，-80 ℃条件下保存的4种方法均在保菌第1个月内活菌株有较明显下降可能也与冻融有关。故在实际应用中，需尽量避免反复冻融，对保存的菌种应速取速放。
综上所述，本研究以定量的方式比较了5种方法保存香港海鸥菌的效果，成功建立简单实用的短期保存法和长期保存法。菌落形成单位这种定量的方法，其结果比定性方法更形象，更客观，以期为香港海鸥菌的保存工作提供技术参考。
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