2017, Vol. 33
国家环保部公布城市空气质量日报显示，2013年空气污染指数(air pollution index，API)最高的城市在京津冀地区中有7个[1]。严重的空气污染压力将给人民生活带来巨大影响，尤其是空气中的大气细颗粒物(particulate matter less than 2.5 μm in aerodynamic diameter, PM2.5)。PM2.5可通过呼吸道进入人体，引起咳嗽和气喘，还能进一步导致或加重哮喘、心血管疾病、慢性支气管炎、肺气肿和肺炎，导致急诊和住院人群增加，甚至还与人群的死亡率密切相关。世界卫生组织在2005年颁布的空气质量指南(air quality guidelines, AQGs)中限定PM2.5的目标年均浓度为≤10 μg/m3，当PM2.5的年均浓度上升至35 μg/m3时，长期死亡风险将较目标年均浓度增加15%[2]。而中国2013年北京市的年均PM2.5浓度为89.5 μg/m3[3]，远超过目标年均浓度。近年来，各界对PM2.5的关注日益提高，为了更详细地了解PM2.5对人群健康的危害，为进一步研究PM2.5对机体的危害提供理论依据，本文对PM2.5在动物实验中氧化应激和炎症反应的研究进展进行如下综述。
1 PM2.5的来源大气PM2.5指悬浮在大气中空气动力学直径＜2.5 μm的细颗粒物，其主要来源为燃料燃烧和机动车尾气。而不同季节的PM2.5来源不同，这些颗粒物夏季主要来源于交通污染，冬季则受生活环境及习惯的影响，主要来源于燃煤及木材燃烧，这使得冬季的颗粒物浓度大大增加。罗斌等[4]研究认为，冷空气对于大气颗粒物有搅动作用，使得空气中PM2.5的悬浮增加，从而增加因其所导致的系统炎症，其采用单独低温刺激和低温刺激加气管滴注预冷8 mg的PM2.5结果显示，PM2.5染毒的肺组织中白介素6(interleukin-6，IL-6)和C反应蛋白(C-reaction protein，CRP)水平均有升高，且低温刺激增加更为显著。环境中植物对PM2.5的作用也不容忽视。王会霞等[5]研究发现，在单位绿地面积层次上，对PM2.5等颗粒物的滞留量较高的树种有二球悬铃木、垂柳、元宝枫、榆树等，中等的有油松、雪松、大叶黄杨等，较弱的有日本小檗、黄杨、小叶女贞等，这也对中国重度污染的城市提供了新的行道树规划物种。美国于1997年首次颁布了PM2.5的空气质量标准[6]，而我国也在2012年将PM2.5纳入常规的空气质量检测中[7]，并控制其排放量，以期达到减轻污染维护健康的目的。
2 PM2.5对实验动物肺部氧化应激及炎症反应的流行病学调查有研究表明，颗粒物是急慢性心血管疾病、肺部疾病、癌症及死亡等负面健康效应的重要危险因素[8-9]。Zhang等[10]将1、10、100 μg PM2.5分别滴注到卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏和哮喘的小鼠气管内，可测得100 μg PM2.5能大大增强肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ)、白介素4(interleukin-4，IL-4)和白介素10(interleukin-10，IL-10)的表达，提示PM2.5能协同过敏原增加哮喘的严重程度，这一影响可能与T helper cell type 2 (Th2)细胞免疫有关。Ma等[11]针对辽宁省沈阳市交通警察进行了流行病学调查，并利用大鼠进一步进行氧化DNA损伤分析，彗星实验结果显示，接触组(包括现场警察和暴露组大鼠)均较对照组有明显的DNA损伤。有研究表明，孕期母鼠暴露于空气悬浮颗粒物污染可增加后代的哮喘易感性[12]。Harkema等[13]也研究证实了大鼠暴露于柴油机排放物可导致以巨噬细胞升高为主的肺脏炎症。PM2.5的影响巨大，甚至可以通过phosphatidyl-inositide 3 kinase/serine threonine protein kinase (PI3K/Akt)信号转导通路对雄性Sprague-Dawley (SD)生殖大鼠产生氧化应激障碍，这正是Cao等[14]的最新研究成果。Sigaud等[15]研究表明，健康人群暴露于松木粉尘可引起支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)中嗜酸细胞、T细胞、肥大细胞升高。可见PM2.5导致的肺部炎症因PM2.5成分、粒径大小、吸入方式、剂量的不同而导致的炎症类型各异。
3 PM2.5 对实验动物肺部氧化应激及炎症反应的表现及机制 3.1 PM2.5暴露后实验动物的临床症状及病理结刘菁等[16]研究显示，雄性Wistar大鼠在连续3个月每日暴露PM2.5后出现活动及进食减少、呼吸急促、间断咳嗽、毛发无光泽、体重下降的症状，肺功能显示潮气量、呼气峰流速减低，BALF中细胞总数、淋巴细胞数、中性粒细胞数增多，淋巴细胞比例、中性粒细胞比例增高，且烟熏PM2.5组与气管滴注组有类似表现。SD大鼠急性一次染毒24 h后处死检测结果显示，与对照组相比，各剂量组(3.75、7.5、15 mg/kg)均表现出不同程度的肺间质和肺泡腔内炎性细胞浸润、中性粒细胞数量增加、肺泡间隔略增厚等病理学改变[17]，而小鼠2 mL/kg急性一次染毒24 h后可见单核细胞浸润及淋巴细胞增生，并伴有粘膜损伤和血管出血等病理解剖表现[18]。
3.2 PM2.5对实验动物肺部氧化应激的影响 3.2.1 器官损伤PM2.5在进入靶细胞后，被肺泡巨噬细胞吞噬，产生炎症因子进入血液，加快肺部疾病的发展进程或导致出现其他器官的损伤。异丙肾上腺素处理的大鼠较生理盐水处理的大鼠心室复极时间增长，异质性增加；而暴露在金属含量丰富的PM2.5(580 μg/m3)4 h中的处理组出现收缩压降低、潮气量增加、心率变异性增大和房室传导阻滞，肺部中性粒细胞、巨噬细胞和总氧化状态均增加，暴露恢复8周后再次测量，在异丙肾上腺素处理大鼠中仍存在上述情况，因此在有心脏疾病的人群中，PM2.5的暴露更容易产生氧化应激、炎症、通气损伤和心律失常[19]。在针对成年雄性BALB/c小鼠进行PM2.5气管滴注后，BALF中的白蛋白和总蛋白有明显升高，中性粒细胞有5~10倍增加，cytochrome P450 1B1 (CYP1B1)基因表达显著增加[20]。意大利米兰冬季的PM2.5颗粒中含有硝酸盐、有机碳、多环芳烃和铅、铝、锌、铁、铬等金属元素，将此种PM2.5进行剂量为0.3 mg的成年雄性BALB/c小鼠气管滴注，发现在心肌细胞和肺组织中均有明显的endothelin-1 (ET-1)、heat shock protein 70 (Hsp70)、cytochrome P4501A1 (Cyp1A1)、Cyp1B1、heme oxygenase-1 (HO-1)和myeloperoxidase (MPO)的表达增加[21]。这类氧化应激意味着PM2.5所致的肺部的氧化应激反应很可能会影响到心脏的功能，对心肌细胞产生有害作用，对于心脏病患者是危险因素。
3.2.2 线粒体损伤PM2.5在进入靶细胞(主要是呼吸道上皮细胞和肺泡巨噬细胞)后，会附着在上皮细胞上或被肺泡巨噬细胞吞噬，产生炎症因子或生成过量自由基或活性氧，破坏线粒体及细胞结构，最终产生细胞损伤。雄性Wistar大鼠急性一次气管滴注24 mg PM2.5及低温(0、10、20 ℃)刺激会出现肺细胞的损伤和线粒体肿胀、空泡及增多现象。而雄性Wistar大鼠口鼻式吸入暴露在浓度为(300±60)μg/m3的PM2.5中 1、3、5 h后，血清乳酸脱氢酶增加，心肺组织活性氧增加，且肺部有特异性的manganese superoxide dismutase (MnSOD)基因表达增加水平较高[22]。气管滴注PM2.5还会导致超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的下降和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的升高，提示PM2.5的吸入会引起动物系统氧化和抗氧化失衡，进而引起氧化应激效应。据报道，大气颗粒物中的金属元素、脂多糖和多环芳烃等成分可诱导组织或细胞产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，造成氧化损伤，已经发炎的肺部可能因为更广泛的颗粒物而引起的氧化应激产生更大的损害[23]。李瑞金[24]将SD大鼠通过气道染毒PM2.5，浓度为0、0.375、1.5、6、24 mg/kg·bw，检测结果显示，大鼠肺组织optic atrophy 1 (OPA1)和mitofusin 1 (Mfn1)的mRNA表达先增高后降低，可认为下调OPA1和Mfn1基因表达和上调dynamin-related protein 1 (Drp1)基因表达降低了线粒体的融合，促进了分裂过程，导致线粒体融合和分裂出现异常[25]。线粒体产生大量的ROS可导致细胞器、DNA以及膜结构等损坏，甚至导致细胞凋亡、坏死[26]。肺组织中SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活力均降低，而肺组织中反应内皮功能的inducible nitric oxide synthase (iNOS)、endothelial nitric-oxide synthase (eNOS)和intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) mRNA基因表达则有不同的变化，控制氧化应激水平的抗氧化和脱毒机制的失败将导致随后更为严重的反应，并进一步引发炎症和激活细胞凋亡或坏死，最终导致肺部疾病[27]。李娟等[28]用PM2.5刺激人支气管上皮细胞(human tracheobronchial epithelial cells, BEAS-2B细胞)时发现，染毒组的ROS水平和MDA含量均明显高于对照组，提示PM2.5可引起BEAS-2B细胞的脂质过氧化损伤。
3.3 PM2.5对实验动物炎症反应的影响 3.3.1 炎症因子的产生有研究认为，炎症因子的产生是因为颗粒物的刺激导致肺泡巨噬细胞释放出部分的细胞因子和前炎症因子，而前炎症因子又可进一步刺激成纤维母细胞、肺上皮细胞，促进其分泌细胞因子和黏附因子，而这些细胞因子及黏附因子可引起各种炎症细胞聚集[29-30]，而某些炎性因子的增加会引发心血管毒性，从而造成心肺功能的同时损伤。在北京、西安、香港和磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)对照的PM2.5气管滴注实验中，第0 d和第7 d针对6周龄雌性BALB/c小鼠分别接受50和150 μg的PM2.5，并在第14 d处死小鼠取BALF，PM2.5暴露后肺组织中的钙调蛋白下降，可认为钙调蛋白是有剂量依赖性表达；在此三地获得的PM2.5均可使干扰素-γ、白介素2(interleukin-2，IL-2)、IL-4、IL-6和IL-10的水平升高，并呈现剂量-反应关系[31]。
3.3.2 炎症的表现在小鼠哮喘模型中，气管滴注PM2.5可见大量黏液分泌、杯状细胞肿胀明显、气管结构紊乱、纤毛脱落，并可见较多溶酶体，且随着剂量的增大，损伤表现更为明显[32]。SD大鼠在气管滴注后一周肺部炎症有所减轻，但病理结构破坏无缓解，而在2周后这些炎症指标的检测结果又再度升高[33]，表明PM2.5的肺部损伤作用持续时间长，作用强烈。2.5、5、10 mg/kg PM2.5分别染毒小鼠24 h、72 h、7 d、14 d，可见Th2相关的细胞因子白介素5(interleukin-5，IL-5)和IL-10呈剂量依赖性增加，在血液中IL-4、IL-5、IL-10也呈增加状态，这些结果均表明PM2.5的急性暴露会引起急性炎性反应，并导致Th2相关的炎症反应[34]。Chen[35]将5只雄性SD大鼠不间断全身暴露于含PM2.5浓度为(16.7±10.1)μg/m3的环境空气中8个月，而对照组5只大鼠给予吸入过滤后的空气，采用超高效液相色谱-串联质谱测定磷酰胆碱酯酶，发现暴露组大鼠的不饱和胆碱酯酶增加，这会降低膜的流动性，并进一步导致细胞功能和细胞信号的改变。
3.3.3 炎症所致肺纤维化在A549细胞和经transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)处理的人肺成纤维化细胞共培养来代替肺泡II型细胞和肺成纤维细胞的实验中，低浓度香烟提取物会增加肌成纤维细胞增殖，增加A549细胞胞外分泌H2O2及上皮细胞-间质的转换作用，提示低浓度香烟提取物及其中的颗粒可能通过增加氧化应激参与了肺间质纤维化的发展[36]。肖纯凌等[37]通过制备大气混合污染物的动物模型观测染毒不同时期大鼠气管和肺泡的超微结构变化时发现，随着染尘染毒剂量的增高，气管上皮纤毛粘连、紊乱，中剂量PM2.5染毒可使肺纤维增生、肺泡腔变小，高剂量 PM2.5染尘染毒30 d可使肺泡上皮细胞脱落溶解。由此可见，PM2.5可导致大鼠气管纤毛的摆动功能减弱及丧失，导致其排出功能障碍。
4 小 结综上所述，PM2.5对动物实验中氧化应激和炎症反应具有影响。PM2.5能增加细胞氧化应激并导致线粒体损伤及细胞损伤，同时可诱导多种细胞因子的表达增加。然而目前的研究大多数仅停留在验证PM2.5对机体损伤的阶段，仍存在一些不足，例如对BALF中的各种指标均进行检测，这既不划算又耗费人力物力财力，如能对各个检测指标之间是否存在共通性做进一步研究，用一种指标代表一类指标，则能通过这些指标逐步解释分子、蛋白、细胞、器官水平的损伤等问题。此外，可吸入颗粒物质作为一种成分复杂、无处不在却又处于不断变化中的污染物质，使得PM2.5对机体的损伤机制研究变得较为复杂。根据PM2.5对动物的氧化应激及炎症反应的研究结果，多领域的科研工作者应共同努力做进一步的预防及治疗研究，如，根据PM2.5的损伤机理有针对性的设计实验模型，验证特殊药品、保健品对其的预防治疗作用，将研究的成果与人体健康相互联系等。
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