中国公共卫生  2016, Vol. 32 Issue (8): 1062-1065   PDF    
引用本文
张春江, 陈建平, 赵丹, 陈志刚, 杨晓萍. 活性维生素D3对大鼠肾小球系膜细胞增殖影响[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(8): 1062-1065.
ZHANG Chun-jiang, CHEN Jian-ping, ZHAO Dan, et al . Effect of 1, 25-dihydroxyvitamin D3 on proliferation of rat glomerular mesangial cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(8): 1062-1065.
活性维生素D3对大鼠肾小球系膜细胞增殖影响
张春江1, 陈建平2, 赵丹1, 陈志刚3, 杨晓萍1     
1. 石河子大学医学院第一附属医院肾病科, 新疆 石河子 832008 ;
2. 石河子大学医学院 ;
3. 石河子大学医学院第一附属医院中心实验室
收稿日期: 2014-11-18; 数字出版日期: 2015-07-07 8:28.
基金项目: 国家自然科学基金（81160090）；新疆石河子大学博士基金（RCZX201026）
作者简介: 张春江(1978-), 男, 新疆石河子人, 主治医师, 医学硕士, 研究方向:肾小球疾病发生机制。
通讯作者: 杨晓萍, E-mail:sbkyxp@163.com
摘要: 目的 探讨活性维生素D3（1, 25（OH）2D3）对大鼠系膜细胞增殖的影响。 方法 体外培养大鼠系膜细胞，随机分为正常对照组、表皮生长因子（EGF）（10ng/mL）组、1, 25（OH）2D3（10-8mol/L）组、EGF联合1, 25（OH）2D3组，采用MTT法检测各组干预48 h后对大鼠系膜细胞增殖的影响，流式细胞术检测各组干预48 h后大鼠系膜细胞周期分布情况，免疫荧光法检测各组干预48h后，大鼠系膜细胞中增生性细胞核抗原（PCNA）的表达情况。 结果 与正常对照组比较，EGF组能明显促进大鼠系膜细胞增殖，G0/G1期细胞减少, S期及G2/M期细胞增加，且PCNA表达增加, 1, 25（OH）2D3组大鼠系膜细胞增殖受抑制，G0/G1期细胞增加，S期及G2/M期细胞减少，且PCNA表达降低；与EGF组比较，EGF联合1, 25（OH）2D3干预组系膜细胞增殖受抑制，G0/G1期细胞增多，S期及G2/M期细胞减少，且PCNA表达降低。 结论 1, 25（OH）2D3可阻滞大鼠系膜细胞的细胞周期并抑制大鼠系膜细胞的增殖和EGF对大鼠系膜细胞的促增殖作用。
关键词： 1, 25(OH)2D3     肾小球系膜细胞     表皮生长因子(EGF)     细胞增殖     增生性细胞核抗原(PCNA)    
Effect of 1, 25-dihydroxyvitamin D3 on proliferation of rat glomerular mesangial cells
ZHANG Chun-jiang1, CHEN Jian-ping2, ZHAO Dan1, et al     
Division of Nephrology, The First Affiliated Hospital of Medical College, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang Uygur Autonomous Region 832002, China
Abstract: Objective To explore the effect of 1, 25-dihydroxyvitamin D3 (1, 25[OH]2D3) on the proliferation of cultured rat glomerular mesangial cells. Methods The cultured rat glomerular mesangial cells were divided into four groups:normal control, epidermal growth factor (EGF)(10ng/mL), 1, 25 (OH)2D3 (10-8mol/L), and EGF plus 1, 25 (OH)2D3 group and all the cells were treated for 48 hours.The cell proliferation was measured with methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) colorimetric method; the cell cycles were measured with flow cytometry; and the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was measured with immunofluorescence staining. Results Compared with those of the normal control group, the proliferation of rat glomerular mesangial cells in EGF group was promoted, with a decrease in the ratio of the cells in G0/G1 phase and an increase of cells in S and G2/M phases, and the expression of PCNA was increased.The proliferation of rat glomerular mesangial cells in 1, 25 (OH)2D3 group was inhibited, with an increased ratio of cells in G0/G1 phase and a decreased ratio of cells in S and G2/M phases, and the expression of PCNA was decreased.Compared to those of the EGF-only treatment group, the proliferation of rat glomerular mesangial cells in EGF plus 1, 25 (OH)2D3 group was inhibited, with an increased ratio of cells in G0/G1 phase and a decreased ratio of cells in S and G2/M phases, and the expression of PCNA was decreased. Conclusion Treatment with 1, 25 (OH)2D3 can significantly impact cell circle and inhibit both the proliferation of rat glomerular mesangial cells and the promotional effect of EGF on the proliferation of rat glomerular mesangial cells.
Key words: 1, 25-dihydroxyvitamin D3     glomerular mesangial cell     epidermal growth factor     cell proliferation     proliferating cell nuclear antigen    

增生性肾小球肾炎的早期多表现为肾小球系膜细胞数量的异常增多，而系膜细胞的数量又受细胞增殖与细胞凋亡的双重影响。因此，寻找能够抑制系膜细胞增生的药物对于治疗临床上进展性的肾小球损害具有重要意义。研究发现，表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)能够促进大鼠系膜细胞的增殖[1]，而活性维生素D3(1, 25(OH)2D3)除经典的钙、磷调节作用外，还具有抑制细胞的增殖、诱导细胞的分化及促进细胞凋亡等作用[2-3]。本研究通过体外培养大鼠系膜细胞，给予活性维生素D3及EGF干预，以观察活性维生素D3对大鼠系膜细胞增殖的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器大鼠肾小球系膜细胞株

(HBZY-1(武汉博士德生物工程有限公司)。碘化丙啶(南京凯基公司)、1, 25(OH)2D3(美国Sigma公司)、EGF(美国Sigma公司)、低糖DMEM粉剂(美国Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，杭州四季青公司)，胰蛋白酶(美国Amresco公司)，RNA酶(上海生工公司), 四甲基偶氮唑蓝(美国Amresco公司)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，上海生工公司)、兔抗大鼠PCNA抗体、FITC标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)。激光共聚焦显微镜(德国CRAL ZEISS公司)、流式细胞仪(德国Partec公司)、酶标仪(美国BIOTEK公司)、倒置显微镜及专用照相机(日本Olympus公司)。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养

大鼠肾小球系膜细胞株复苏后用含10%胎牛血清的低糖DMEM完全培养基在5% CO2、37 ℃饱和湿度条件下培养，当细胞生长至70%~80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代继续培养，细胞传代培养至第3~8代用于实验。

1.2.2 实验分组

收集对数期大鼠系膜细胞，计数后接种于培养板中，培养至细胞完全贴壁，去除培养基，无血清DMEM同步化24 h后，分为正常对照组，EGF(10 ng/mL)组，1, 25(OH)2D3(10-8 mol/L)组，EGF+1, 25(OH)2D3组, 正常对照组加入同体积的含1% FBS的低糖DMEM培养基, 在5% CO2、37 ℃饱和湿度条件下干预48 h。

1.2.3 四甲基偶氮唑盐法(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)检测各组系膜细胞增殖情况

收集对数期大鼠系膜细胞，以1×104个/mL接种于96孔板内，200 μl/孔，待细胞贴壁后，无血清DMEM同步化24 h后，按照实验分组干预培养48 h，各组结束干预前4 h，用倒置显微镜观察各组大鼠系膜细胞的形态并拍照，然后向每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL), 继续培养4 h后，去除上清，加入DMSO，室温避光振荡10 min后，用酶标仪测定各孔在490 nm波长处的吸光度值(A490)，每组设4个复孔，设置空白调零孔(只加低糖DMEM及MTT溶液)，以上实验重复3次，并按下列公式计算各组细胞平均抑制率：抑制率(inhibition rate, IR)=(A对照组值-A实验组值)/(A对照组值)×100%。

1.2.4 流式细胞术检测各组系膜细胞的细胞周期情况

收集对数期大鼠系膜细胞，以2×105个/mL接种于6孔板内，2 mL/孔，待细胞贴壁后，无血清DMEM同步化24 h后，按照实验分组干预培养48 h，每组设4个复孔，48 h后收集细胞，用预先冻存的70％冰乙醇重悬细胞，吹打混匀，4 ℃固定过夜。过夜后离心去除乙醇，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤3遍，再用500 μL 1×PBS重悬细胞，加入RNA酶(10 mg/mL)12.8 μL及碘化丙啶染液(终浓度为50 μg/mL)5 μL，37 ℃避光保存30 min以上，上机检测。实验重复3次。

1.2.5 免疫荧光法检测各组系膜细胞中PCNA的表达情况

收集对数期大鼠系膜细胞，以2×104个/mL接种于提前放置盖玻片的24孔板内，1 mL/孔，待细胞贴壁后，无血清DMEM同步化24 h后，按照实验分组干预培养48 h，每组设4个复孔，48 h后取出盖玻片，冷丙酮固定, 山羊血清封闭，然后滴加兔抗大鼠PCNA抗体(1：100)于4 ℃冰箱过夜，过夜后滴加异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的山羊抗兔IgG，避光室温反应2 h，最后用甘油封片，立即用激光共聚焦显微镜测荧光强度并采图。

1.3 统计分析

计量资料均以x表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用least standard deviation(LSD)-t检验，采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠肾小球系膜细胞形态学观察

正常对照组细胞胞体呈梭形、不规则星形，可见树枝状突起部分突起相互融合成网格形，细胞质透亮，折光性好，细胞核色深，呈圆形，可见分裂的细胞核；与正常对照组比较，EGF组干预48 h后，细胞形态变化不大，但细胞生长明显增快，高倍镜下观察可见较多的分裂细胞核；1, 25(OH)2D3组干预48 h后，细胞数有所减少，细胞膜皱缩，细胞体积较对照组变小，细胞核略小，部分胞浆中可见空泡形成，EGF+1, 25(OH)2D3组，细胞生长状况仍欠佳，细胞呈梭行，细胞质的折光性欠佳，细胞核体积略小，胞质中可见少量空泡形成。

2.2 活性维生素D3对大鼠系膜细胞增殖的影响(表 1)
表 1 活性维生素D3对大鼠系膜细胞增殖影响(48 h)

与正常对照组比较，EGF(10 ng/mL)组干预大鼠系膜细胞48 h后，能促进系膜细胞的增殖(P < 0.01)，1, 25(OH)2D3(10-8mol/L)干预大鼠系膜细胞48 h后，系膜细胞的增殖被抑制(P < 0.05)；而与EGF(10 ng/mL)组比较，EGF联合1, 25(OH)2D3组干预大鼠系膜细胞48 h后，对大鼠系膜细胞的增殖有抑制作用(P < 0.01)。

2.3 活性维生素D3对大鼠系膜细胞细胞周期的影响(表 2)
表 2 活性维生素D3对系膜细胞细胞周期影响(x±s)

与正常对照组比较，EGF干预组G1期细胞明显减少，而S期及G2/M期细胞增多(P < 0.01), 1, 25(OH)2D3组大鼠系膜细胞被显著阻滞于G1期，进入S期及G2/M期的细胞明显减少(P < 0.01)；与EGF组比较，EGF联合1, 25(OH)2D3组大鼠系膜细胞也被显著阻滞于G1期(P < 0.01)。

2.4 活性维生素D3对系膜细胞中PCNA表达影响

激光共聚焦显微镜观察显示，PCNA主要表达在细胞核中，胞浆中也有少量表达。与正常对照组比较，EGF组系膜细胞PCNA的表达明显增多(P < 0.01)，1, 25(OH)2D3组系膜细胞PCNA的表达量明显减少(P < 0.01)；与EGF组比较，EGF+1, 25(OH)2D3组系膜细胞的PCNA表达明显减少(P < 0.01)。

3 讨论

研究发现EGF可以通过与相应的受体结合，进而激活PI3K/Akt/mTOR通路，从而促进细胞的生长及增殖[4-5]，而1, 25(OH)2D3与维生素受体以配体依赖的方式结合并调节细胞的增殖与分化[6]。随着对1, 25(OH)2D3生物效应研究的深入，其在肾小球疾病的保护作用得到进一步证实[7-10]，但1, 25(OH)2D3对系膜细胞的增殖作用及机制尚不清楚。

本研究结果显示，与正常对照组比较，1, 25(OH)2D3组干预大鼠系膜细胞48 h后，系膜细胞生长受抑制。提示，1, 25(OH)2D3对大鼠系膜细胞的生长具有抑制作用，这与前期研究结论一致[11-12]；而与EGF组比较，EGF+1, 25(OH)2D3联合干预组大鼠系膜细胞的增殖受到抑制。提示，1, 25(OH)2D3对EGF刺激增殖的大鼠系膜细胞有抑制作用。

本研究结果显示，与正常对照组比较，1, 25(OH)2D3干预大鼠系膜细胞48 h后，G0/G1期细胞显著增加，S期及G2/M期细胞显著减少，表明1, 25(OH)2D3组大鼠系膜细胞的细胞周期发生障碍，细胞增殖受到抑制，EGF组干预大鼠系膜细胞48 h后，G0/G1期细胞明显减少，S期及G2/M期细胞明显增加，表明EGF组可促进细胞周期进程。而与EGF组比较，EGF+1, 25(OH)2D3联合干预组大鼠系膜细胞G0/G1期细胞明显增加，S期及G2/M期细胞明显减少，表明与EGF组比较，EGF+1, 25(OH)2D3联合干预组大鼠系膜细胞的细胞周期亦发生障碍，细胞增殖受到抑制，表明1, 25(OH)2D3能够抑制EGF对大鼠系膜细胞的促增殖作用。

增殖性细胞核抗原(PCNA)是广泛存在于真核生物细胞核内的一种细胞周期调控蛋白，在细胞周期的G1晚期开始合成增加，于S期合成达到高峰，在G2期开始下降，因此PCNA只会出现在处于有丝分裂的细胞中，可作为评估细胞增殖状态的指标。有研究发现，大鼠系膜细胞内PCNA的表达情况可较为客观的反应系膜细胞的增殖程度[13-14]。本研究结果显示，与正常对照组相比，1, 25(OH)2D3组大鼠系膜细胞中PCNA的表达明显降低。提示，1, 25(OH)2D3可通过抑制PCNA的表达而抑制大鼠系膜细胞的增殖；EGF组大鼠系膜细胞中PCNA的表达明显增加，提示EGF可通过上调PCNA的表达继而促进大鼠系膜细胞的增殖；而与EGF组比较，EGF联合1, 25(OH)2D3组大鼠系膜细胞中PCNA的表达明显降低。提示，1, 25(OH)2D3可抑制EGF对大鼠系膜细胞中PCNA的促表达作用，从而进一步证实1, 25(OH)2D3可通过抑制PCNA的表达而抑制系膜细胞的增殖。

综上所述，1, 25(OH)2D3通过抑制细胞周期和PCNA蛋白表达，从而抑制大鼠系膜细胞的增殖，且1, 25(OH)2D3可以抑制EGF对大鼠系膜细胞的促增殖作用。然而，更深层次的作用机制以及相关信号传导蛋白的变化尚未涉及，有待于今后进一步研究。

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