2016, Vol. 32
活性氧(reactive oxygen species，ROS)包括臭氧(O3)、单线态氧(1O2)、过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子自由基(O2-)和羟自由基(·OH)等。许多正常的细胞活动均会持续产生ROS，生理情况下ROS会被广泛表达的抗氧化蛋白如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)等所拮抗，因而不会造成细胞损伤。多种外源性因素如环境毒物、低氧、高氧、应力拉伸等可刺激机体产生过量ROS。当ROS不能被抗氧化酶有效清除时，则会导致氧化应激，对细胞造成损伤。许多疾病发生过程中均存在氧化应激过程，然而氧化应激与疾病的关系尚存争议。这主要与ROS的双面性作用有关，一方面，ROS可通过对细胞大分子(如DNA、蛋白质、磷酯等)的破坏损伤细胞的生理功能，继而导致一些病理过程[1]；另一方面，ROS可以作为第二信使在细胞信号转导和调节中发挥重要作用，如导致氧化还原敏感蛋白激活，或修饰蛋白质使其活性增高或降低，由此间接参与免疫反应或其他细胞保护作用过程[2]。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是对抗氧化应激的上游转录因子，调控抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶等多种保护性蛋白的转录表达[3]。研究认为ROS通过对Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH2 associated protein 1，Keap1)进行修饰，导致Keapl的构像发生改变，使Nrf2与Keapl解耦联，从而使Nrf2活化[4]。但近年来，实验证据提示丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)和磷脂酰肌醇-3-激酶／蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)等一些重要信号转导通路参与ROS对Nrf2的激活，以应对氧化应激对细胞造成的损伤。本文针对活性氧通过MAPKs和PI3K/AKT通路激活Nrf2研究进展综述如下。
1 ROS对Nrf2的激活Nrf2是细胞对抗氧化应激最重要的转录因子之一。正常情况下，Nrf2在细胞质中与其负调节者Keap1结合，并被泛素化降解，从而维持在一个很低的水平。当细胞处于氧化应激状态时，Nrf2与Keap1解离，进入核内，与小Maf蛋白共同结合于抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)。ARE是位于许多细胞保护性基因启动子区域的一段DNA结合序列，这些细胞保护性基因包括Ⅱ相解毒酶类、多药耐药相关蛋白、抗氧化蛋白类及抗炎蛋白等[5]。因此，Nrf2与ARE的结合能激活上述细胞保护性基因的转录，启动或增强细胞的抗氧化应激、药物代谢和抗炎症反应等功能。
研究发现ROS主要通过下列途径激活Nrf2：(1)对Keap1中干预区域(IVR)的C273、C288或C151半胱氨酸残基的巯基基团进行修饰，引起Keap1构象改变，导致其与Nrf2解离或Nrf2的泛素化降解减少[6]，Nrf2即可进入细胞核发挥作用，这也是Nrf2激活的经典机制；(2)直接作用于Nrf2半胱氨酸残基，使Nrf2的核定位信号激活或促进Nrf2与Keap1分离，从而使Nrf2在细胞核中的含量增多，活性升高；(3)通过激活MAPKs、PI3K/AKT等信号通路，继而磷酸化Nrf2蛋白或增强Nrf2的核转位，激活Nrf2。
2 MAPKs在ROS激活Nrf2中的作用MAPKs是一类丝一苏氨酸激酶家族，其中研究较清楚的3个亚族分别是c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和p38 MAPK信号分子。
2.1 ROS激活MAPKsROS能诱导MAPK通路活化，研究证据分为如下3类：(1)多种细胞接受外源刺激产生ROS后，同时细胞内MAPK信号分子活化。(2)抗氧化剂可以阻止MAPK磷酸化。(3)将细胞直接暴露于外源性H2O2来模拟氧化应激，可导致MAPK通路激活。
2.1.1 不同细胞中ROS的过量产生伴有MAPK信号通路活化在人肺腺癌A549细胞中2-甲氧基-1, 4-萘并醌诱导产生的ROS可激活JNK和p38 MAPK信号通路[7]。鸡胚胎心肌细胞在低氧条件下，ROS生成显著升高，并参与p38信号分子的磷酸化[8]。中国仓鼠肺成纤维细胞中吩嗪硫酸甲酯诱导产生的O2-可以使p38信号通路激活[9]。小鼠胰腺β细胞中棕榈酸酯诱导产生的ROS可使JNK的183Thr/185Tyr磷酸化，激活JNK[10]。
2.1.2 降低细胞内ROS水平可以抑制MAPKs通路的激活抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)预处理人结肠癌SW620细胞后，ROS诱导的JNK磷酸化水平明显降低[11]。谷胱甘肽可阻止绿脓菌素诱导的人肺癌A549细胞中ERK1/2的磷酸化[12]。采用软脂酸处理人肝细胞后，ROS产生增加，p38和ERK磷酸化增加，而NAC或过氧化氢酶预处理，可明显降低p38和ERK的磷酸化水平[13]。此外，Ruffels等[14]用1 mmol/L的H2O2刺激人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，发现ERK1/2的202Thr/204Tyr和JNK的183Thr/185Tyr的磷酸化水平均明显增加，提示ROS对于MAPK信号通路具有激活作用。
2.1.3 ROS介导MAPKs信号分子磷酸化机制有研究报道ROS可以磷酸化大鼠胸主动脉原代血管平滑肌细胞的表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)，继而诱导Src蛋白的磷酸化，最终使ERK1/2磷酸化，激活ERK1/2[15]。另有研究发现ROS激活JNK/p38是由于ROS氧化上游信号分子ASK1的结合蛋白，使其与ASK1分离，ASK1被激活，进而使JNK/p38磷酸化[16]。Day等[17]报道H2O2可以直接氧化MAPKs信号分子的半胱氨酸残基而激活MAPKs。此外，ROS还可以氧化MAPK磷酸酶，使其失活，导致JNK的持续磷酸化而持续激活[18]。
2.2 MAPKs激活Nrf2MAPK通路的活化可以使Nrf2磷酸化、促进Nrf2的核转位或增加Nrf2的表达，继而促进Nrf2的下游基因转录表达。高氧能诱导小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中ERK和Nrf2的磷酸化，而ERK抑制剂U0126使高氧条件下的Nrf2磷酸化明显下降；采用ERK1/2突变体转染细胞发现，突变ERK抑制了Nrf2的核转位[19]。原儿茶酸处理的小鼠巨噬细胞系J774 A.1细胞中，Nrf2 mRNA和蛋白表达水平上升、磷酸化及核转位增强、下游基因GPx、GR表达上升；使用JNK抑制剂或使JNK基因沉默后，不仅Nrf2的蛋白水平降低，而且原儿茶酸诱导的Nrf2磷酸化以及核转位明显被抑制，GPx、GR表达上升的现象也消失，提示JNK激酶参与Nrf2的活化[20]。在U87和U251胶质瘤细胞中，抑制p38 MAPK的磷酸化降低替莫唑胺处理细胞中Nrf2蛋白表达水平，表明Nrf2的激活依赖于p38 MAPK的激活[21]。此外，银杏提取物可引起酒精暴露的小鼠C2C12成肌细胞中ERK和JNK的活化，Nrf2核积累增强及下游基因HO-1表达上升，ERK抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP600125则使Nrf2核蛋白积累及HO-1表达抑制[22]。Wang等[13]采用软脂酸处理人肝细胞0.5 h后发现，细胞质中Nrf2蛋白的表达快速增加，1 h后观察到明显的Nrf2核转位。p38 MAPK抑制剂SB202190和ERK抑制剂U0126均明显抑制Nrf2蛋白表达以及核积累，提示软脂酸可以通过ERK和p38 MAPK刺激Nrf2的表达及核转位。
3 PI3K在ROS激活Nrf2中作用PI3K活化可磷酸化质膜上的磷脂酰肌醇环，产生第二信使3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇，与细胞内丝-苏氨酸激酶AKT结合，激活AKT，而活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等调节细胞的功能[23]。多项研究证实Nrf2是AKT的靶蛋白之一，AKT或其上游PI3K抑制剂均可抑制Nrf2活性，同时，抑制ROS可抑制AKT的活性，因此ROS可以通过PI3K/AKT信号通路激活Nrf2。
3.1 ROS通过PI3K激活Nrf2直接证据Papaiahgari等[24]报道在ROS生成抑制剂二联碘苯存在时，周期性拉伸(cyclic stretch，CS)小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞诱导的PI3K/AKT通路激活被抑制，提示PI3K/AKT的激活是ROS依赖的；PI3K抑制剂LY294002预处理肺泡上皮细胞后，Nrf2与ARE的结合被明显抑制，且Nrf2下游基因Gclc的转录表达明显降低；在AKT低表达的突变细胞株中CS诱导的Nrf2的核积累明显被抑制，表明CS作用下肺泡上皮细胞中Nrf2的活化是通过ROS/PI3K/AKT通路介导的。萝卜硫素处理的人间皮瘤MSTO-211H细胞中ROS和磷酸化AKT水平均明显增加，当用NAC预处理细胞后，磷酸化AKT水平增强现象消失，提示ROS介导PI3K/AKT的激活，而PI3K抑制剂Ly294002预处理细胞抑制了萝卜硫素暴露情况下细胞质中Nrf2蛋白水平的增加和HO-1表达的升高，表明萝卜硫素诱导产生的ROS可通过激活PI3K/AKT导致Nrf2表达及活性增加[25]。在人肺癌细胞A549中，PM2.5诱导ROS产生并导致Nrf2蛋白核转位及HO-1转录表达上升，其中Nrf2及HO-1的改变也被证实是由PI3K/AKT磷酸化介导[26]。
3.2 ROS通过PI3K激活Nrf2间接证据正常人乳腺上皮细胞经17β雌二醇的主要代谢产物4-羟雌二醇处理后，细胞内ROS水平快速增加，且PI3K和AKT的磷酸化水平升高，ROS抑制剂降低PI3K/AKT磷酸化水平[27]，提示4-羟雌二醇诱导的ROS的产生可以激活PI3K/AKT途径。而在大鼠视神经元细胞中观察到17β雌二醇可以提高AKT的磷酸化水平、增加Nrf2的mRNA和蛋白水平以及核转位，PI3K抑制剂LY294002预处理则明显抑制Nrf2的活化，表明PI3K/AKT激活能活化Nrf2[28]。高糖可以诱导鼠原代成骨细胞内ROS的产生和AKT的磷酸化，NAC可抑制AKT的磷酸化[29]。Hamdulay等[30]发现抗炎药塞来昔布可以使人血管内皮细胞AKT的Ser473残基磷酸化并诱导Nrf2的核转位以及HO-1的mRNA及蛋白表达，PI3K抑制剂及AKT突变则抑制Nrf2的核转位以及HO-1的表达。
3.3 ROS通过PI3K激活Nrf2机制ROS激活PI3K使Nrf2活化的机制可能与酪氨酸激酶受体有关，内源性或外源性的ROS均可通过激活EGFR、anexelekto(Axl)等酪氨酸激酶受体使PI3K/AKT磷酸化，从而使Nrf2的核转位增多、与ARE的结合能力增强，即激活Nrf2。在小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中诱导ROS产生可使EGFR和AKT磷酸化水平明显提高，而EGFR抑制剂AG1478预处理可降低AKT的磷酸化水平[24]，提示ROS可通过磷酸化EGFR激活PI3K/AKT信号通路。另有研究发现H2O2提高AKT的磷酸化水平机制为H2O2使酪氨酸激酶受体Axl的酪氨酸磷酸化，从而延长磷酸化AKT的半衰期，使其水平提高。Axl抑制剂R428可削弱磷酸化AKT半衰期延长的现象，表明H2O2诱导的磷酸化AKT水平升高与活化Akl而延长磷酸化AKT的半衰期有关[31]。此外，ROS可以氧化蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员中的phosphatase and tensin homologue(PTEN)，进而增加PI3K/AKT的磷酸化水平，导致PI3K/AKT活化[32]。
尽管有大量实验表明ROS可以通过激活MAPK或PI3K而活化Nrf2，也有实验得出相反的结论。如，抑制肿瘤坏死因子α诱导的大鼠血管平滑肌细胞ERK的激活则使细胞内Nrf2的核积累增多且Gclc表达增加[33]；在糖尿病羊动物模型中观察到ROS的过量产生明显抑制AKT的磷酸化[34]；人鼻中隔癌细胞暴露于镉24 h，虽然发现ROS产生增加、AKT磷酸化增强以及Nrf2激活，但NAC和PI3K抑制剂分别预处理后，尽管镉诱导的AKT磷酸化被抑制，Nrf2的激活却不受PI3K抑制剂的影响[35]。这些结果的不一致性可能与刺激类型、刺激持续时间、实验模型、细胞类型、细胞培养环境和观测时间等因素有关。此外，尚有其他信号通路被证实在ROS介导的Nrf2活化中发挥作用，如Cullinan等[36]证实蛋白激酶样内质网激酶(RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)信号通路依赖的Nrf2的激活在维持细胞氧化还原稳定状态中发挥重要作用；Huang等[37]、Zhang等[38]分别证实PKC通路在ROS诱导的Nrf2蛋白磷酸化以及核转位过程中发挥促进作用。
4 展望鉴于Nrf2在抵抗外源性因素所致氧化应激中的重要作用，其调控机制的深入研究，将为氧化应激相关疾病的防治提供理论依据。大量实验证据直接或间接表明MAPKs、PI3K/AKT 2个重要的信号通路在ROS诱导的Nrf2活化中发挥作用。这些证据一方面为深入研究ROS对Nrf2的活化作用提供了线索，另一方面现有研究大多来自体外实验，有待在体内实验中进一步验证。
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