研究表明，穿膜肽(transcriptional activator protein，TAT)介导的靶向血管内皮细胞生长因子受体(kinase insert domain receptor，KDR)的siRNA慢病毒载体能有效抑制小细胞型肺癌A549细胞的生长和转移，具有细胞感染率高、穿膜作用强等优点，但肿瘤靶向作用有待进一步提高^[1]。精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)是整合素α_vβ₃/α_vβ₅特异性配体，由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的短肽构成，目前已被公认为是肿瘤靶向分子。研究发现，RGD可以高效地结合到肿瘤细胞表面高表达的整合素分子，具有较强的肿瘤细胞选择性和阻断整合素的作用，是肿瘤靶向药物输送，控制肿瘤生长、转移的最有效途径^[2]。本研究在TAT介导的靶向KDR的siRNA慢病毒载体基础上，利用基因重组技术，将RGD序列插入到TAT下游，将TAT的穿膜作用和RGD的肿瘤靶向作用有机结合，构建TAT-RGD-KDR siRNA融合基因慢病毒载体，并观察其抗肿瘤活性，结果报告如下。

TAT-KDR siRNA慢病毒载体、非小细胞肺癌A549细胞株、DH5α感受态菌(沈阳医学院生物化学及分子生物学研究室保存)，细胞培养液、胎牛血清(美国Hyclone公司)，限制性内切酶、T4 DNA连接酶及DNA电泳胶回收、PCR、质粒抽提试剂盒(大连宝生物公司)，抗人KDR抗体和羊抗鼠二抗(美国R＆D 公司)，荧光实时定量PCR试剂盒(德国Qiagen 公司)；引物合成与DNA 序列测定由大连宝生物公司完成。

根据文献^[3]，设计合成编码3个串联RGD-4C(CDCRGDCFCGGGGS)的2条寡核苷酸链。在正义链和反义链的两端分别引入内切酶位点KpnⅠ和HindⅢ。将等摩尔2条寡核苷酸链混合，95 ℃变性10 min，72 ℃退火过夜，获得编码3个串联RGD-4C的双链DNA。

用KpnⅠ和HindⅢ分别对pGC/TAT KDR siRNA质粒DNA和编码3个串联RGD-4C的双链DNA进行双酶切，纯化酶切产物，在T4连接酶作用下16 ℃连接过夜，连接产物转入DH5α感受态细胞，常规进行抗生素筛选，阳性菌落经克隆PCR鉴定后送检测序；测序结果证实pGC/TAT-RGD-KDR siRNA载体构建成功。

将pGC/TAT-RGD-KDR siRNA重组载体和慢病毒包装质粒室温下温育5 min，然后共转染293T细胞，培养8 h后更换含10%胎牛血清的完全改良Eagle培养基(Dulbeccos modification of Eagles medium，DMEM)培养液，继续培养48 h，离心后留取含慢病毒颗粒细胞的上清液，倍比稀释法检测病毒滴度。

取对数生长期A549 细胞，以 2×10³个/孔接种至96孔板，每孔体积200 μL，培养24 h 后更换无血清培养液，同时设立相应量的pGC/TAT-KDR siRNA组、pGC/TAT-RGD KDR siRNA组和未转染组，每组设6个复孔。各组中分别加入10 MOI的pGC/TAT-KDR siRNA重组病毒、pGC/TAT-RGD -KDR siRNA重组病毒，以及等量磷酸盐缓冲液(phosphate belanced solution，PBS)感染2 h后，更换成10%新鲜小牛血清DMEM培养液，待用。 1.3 TAT-RGD-KDR siRNA转染对A549细胞影响 1.3.1 转染对A549细胞KDR蛋白表达影响

采用Western blot法，将感染后的各组细胞培养至细胞贴壁率达到80% 时，用全蛋白裂解液裂解细胞，细胞裂解物中加入5倍十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)，上样缓冲液，100 ℃沸水煮5 min后加样，行Western blot 分析，山羊抗人KDR 1∶3 000稀释，兔抗山羊二抗1∶6 000稀释。

采用real-time PCR法，取对数生长期的各组细胞，Trizol 法提取总 RNA并逆转录为 cDNA，按照试剂说明书，配制总体系为20 μL的反应体系，上机进行Real Time PCR扩增和检测。反应条件、引物参照文献^[1]。

(1)噻唑蓝比色法：各组细胞(每组设6个复孔)中每间隔24 h加入噻唑蓝溶液(5 mg/mL，每孔20 μL)，37 ℃、5%CO₂继续培养4 h，加150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)低速振荡10 min，于波长492 nm测量各孔吸光度(A)值。实验重复3 次，取均值。(2)双色流式细胞仪法：用无乙二胺四乙酸的0.25%胰蛋白酶收集上述各组细胞，离心后用无菌PBS冲洗沉淀，重复2次，用200 μL binding buffer重悬沉淀后，加入2 μL AnnexinV-FITC和5 μL碘化丙啶，流式细胞仪检测细胞凋亡率，激发波长为488 nm，AnnexinV标记细胞发射波长525 nm，碘化丙啶标记细胞发射波长620 nm。

人工基底膜用无血清培养基按1∶9比例稀释后加入每个Transwell小孔(50 μL/孔)，37 ℃条件下培养3 h，消化并计数对数生长期的各组细胞，每个Transwell小室内接种1×10⁵个细胞，培养在200 μL 含0.1%牛血清白蛋白的无血清DMEM中，膜下加500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃、5%CO₂条件下培养24 h；取出小室，棉棒拭去Matrigel和悬浮的细胞，PBS冲洗2～3次，用甲醇、冰乙酸按3∶1比例配制的溶液固定15 min，PBS多次冲洗后，苏木素复染30 min；显微镜下随机选取5个视野计数膜下细胞数，计算细胞的侵袭率。实验重复3 次，计算平均值。

实验数据采用x±s表示，应用SPSS 11.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

测序结果经Blast比对，重组载体中的RGD序列与设计一致，证明pGC/TAT-RGD-KDR siRNA重组载体构建成功。将成功构建的pGC/TAT-RGD-KDR siRNA载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞，培养48 h后留取含慢病毒颗粒细胞的上清液，倍比稀释法进行病毒滴度测定，结果显示病毒滴度为4×10⁹ pfu/L。

结果显示，与对照组比较，pGC/TAT-KDR siRNA组和pGC/TAT-RGD-KDR siRNA组A549细胞KDR mRNA、蛋白表达水平均明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与pGC/TAT-KDR siRNA组比较，pGC/TAT-RGD-KDR siRNA组A549细胞KDR mRNA、蛋白表达水平也明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。提示与pGC/TAT-KDR siRNA比较，pGC/TAT-RGD-KDR siRNA转染具有更强的抑制A549细胞KDR基因表达作用。

表 1

表 1 TAT-RGD-KDR siRNA转染对A549细胞KDR mRNA、蛋白表达影响(%，x±s，n=6) 组别 KDR mRNA KDR蛋白 对照组 100±0.00 100±0.00 pGC/TAT-KDR siRNA转染组 46.3±7.3a 38.9±4.2 a pGC/TAT-RGD-KDR siRNA转染组 22.7±3.9 ab 19.3±2.7ab 注：与对照组比较，a P＜0.01；与pGC/TAT-KDR siRNA转染组比较，b P＜0.01。

表 1 TAT-RGD-KDR siRNA转染对A549细胞KDR mRNA、蛋白表达影响(%，x±s，n=6)

与对照组比较，pGC/TAT-KDR siRNA组和pGC/TAT-RGD KDR siRNA组A549细胞增殖水平下降，呈时间依赖性；培养3 d后，与pGC/TAT-KDR siRNA组比较，pGC/TAT-RGD KDR siRNA组A549细胞增殖水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。提示TAT-RGD- KDR siRNA慢病毒载体具有较强的抑制A549细胞增殖作用。

表 2

表 2 TAT-RGD-KDR siRNA转染对A549细胞增殖影响(OD，x±s，n=6) 组别 培养时间(d) 1 2 3 4 对照组 0.63±0.7 0.69±1.2 0.72±0.8 0.87±0.7 pGC/TAT-KDR siRNA转染组 0.58±1.1 0.43±0.8a 0.38±0.4a 0.26±0.6a pGC/TAT-RGD-KDR siRNA转染组 0.53±0.4 0.38<±0.5a 0.24±0.6ab 0.16±0.3ab 注：与对照组比较，a P＜0.01；与pGC/TAT-KDR siRNA转染组比较，b P＜0.01。

表 2 TAT-RGD-KDR siRNA转染对A549细胞增殖影响(OD，x±s，n=6)

结果显示，对照组、pGC/TAT-KDR siRNA组、pGC/TAT-RGD KDR siRNA组A549细胞凋亡率为分别为(4.5±0.79)%、(24.36±1.37)%、(52.79±4.39)%；与pGC/TAT-KDR siRNA组比较，pGC/TAT-RGD KDR siRNA组A549细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。提示TAT-RGD- KDR siRNA慢病毒载体具有较强的诱导A549细胞凋亡作用。

对照组、pGC/TAT-KDR siRNA组、pGC/TAT-RGD KDR siRNA组通过基质胶到达滤膜底层的A549细胞数目(膜下细胞数)分别为(202.67±8.50)、(85.59±6.03)和(36.0±5.29)个；与对照组比较，pGC/TAT-KDR siRNA组和pGC/TAT-RGD KDR siRNA组膜下细胞数明显减少，细胞侵袭率(分别为42.23%、17.76%)明显下降；与pGC/TAT-KDR siRNA组比较，pGC/TAT-RGD KDR siRNA组下降更明显(P<0.01)。提示pGC/TAT-RGD KDR siRNA转染具有更强的A549细胞体外侵袭抑制能力。

KDR是血管细胞生长因子最重要的受体之一，该基因沉默可阻断肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞的生长和转移^[4,5]。前期研究中，本课题组构建的TAT-KDR siRNA融合基因慢病毒载体具有细胞感染率高、穿膜作用强等优点，但缺乏肿瘤靶向性。RGD是一种含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的具有生物活性短肽^[6,7]。含RGD序列的小分子多肽RGD-4C是对整合素α_vβ₃/α_vβ₅具有高亲和力的配体，广泛存在于哺乳动物细胞中^[8]。研究表明，在多种肿瘤动物模型中RGD-4C均显示出良好的肿瘤靶向作用，同时它还可以携带造影剂或偶联的抗肿瘤药物输送至肿瘤组织^[9]。此外，利用RGD-4C与整合素的相互作用可以改造腺病毒结构，从而提高腺病毒药物载体对肿瘤细胞的靶向性^[10]。

本研究将3个串联RGD-4C重组到TAT-KDR siRNA融合基因慢病毒载体的TAT下游，构建了TAT-RGD-KDR siRNA融合基因慢病毒载体。Real-time PCR和Western blot结果表明，该载体系统与RGD-4C未介导的TAT-KDR siRNA融合基因慢病毒载体相比，具有更强地抑制人肺癌A549细胞KDR基因表达的作用；MTT结果显示，该载体系统对A549细胞增殖抑制作用更强，呈时间依赖性；RGD-4C介导的TAT-KDR siRNA融合基因慢病毒载体转染的A549细胞凋亡率可达(52.79±4.39)%，而RGD-4C未介导的TAT-KDR siRNA融合基因慢病毒载体转染的A549细胞凋亡率仅为(24.36±1.37)%。提示该载体系统具有更强的诱导A549细胞凋亡作用；Transwell 侵袭结果显示，该载体能抑制A549细胞侵袭力。TAT-RGD-KDR siRNA融合基因慢病毒载体可为肿瘤的靶向治疗提供理论依据。