克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)可寄生在人体和动物肠道内，感染婴幼儿等免疫力低下人群，引起脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎等病症^[1]。自2008年起，克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)被划分为一个新属，包括7个种和3个亚种^{[2, 3]}。目前国内对克罗诺杆菌的鉴定方法仅针对该属中的某个或某些种^{[3, 4, 5]}，国外已有学者利用重组和修复蛋白(recombination and repair protein gene，recN)全基因将克罗诺杆菌鉴定到不同种的研究^[6]。本研究在此基础上筛选出recN基因上一段较短且可信度较高的序列，设计并合成相应的扩增引物，基于该段基因序列，PCR扩增后一个测序反应即可将克罗诺杆菌鉴定到种和亚种，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 菌株

实验用菌株为8株国际通用的克罗诺杆菌参考菌株：阪崎克罗诺杆菌(ATCC29544)、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(DSM18702)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(NCTC9529)、苏黎世克罗诺杆菌(DSM18703)、穆汀斯克罗诺杆菌(ATCC51329)以及都柏林克罗诺杆菌3个亚种都柏林亚种(DSM18705)、洛桑亚种(DSM18706)、乳粉亚种(DSM18707)和44株中国检验检疫科学研究院微生物菌种保藏管理中心(IQCC)保存的不同来源的克罗诺杆菌分离菌株，编号分别为30421、30422、30424~30427、30429~30432、30434~30436、10416、10419、10424、10434、10440、10443、10444、30469、30470、30472~30474、10405~10407、10409、10410、10455~10459、10403.23~10403.26、10486~10488、10446、10439。 1.2 主要试剂与仪器

dNTPs(2.5 mmol/L)、Ex Taq(5 U/μL)、10×Buffer(上海宝生物工程有限公司)，DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，脑心浸液肉汤(brain heart infusion broth,BHI)培养基、胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptose Soya Agar,TSA)培养基(北京陆桥技术股份有限公司)，溴化乙锭，细菌微量生化鉴定管(北京奥博星生物技术有限责任公司)。DU640核酸蛋白分析仪(德国Beckman公司)，Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR扩增仪(美国 AB公司)，MODEL 200/2.0 POWER SUPPLY电泳仪(美国BIO-RAD公司)，VersaDoc分子凝胶成像仪(美国 BIO-RAD公司)。 1.3 方法 1.3.1 菌株培养

克罗诺杆菌实验菌株接种在BHI液体培养基中，36 ℃培养过夜，培养后的菌液在TSA平板上划线分离，36 ℃培养24 h。 1.3.2 菌株生化反应种间鉴定^[7]

从实验菌株TSA平板上分别挑取单菌落至5 mL生理盐水中，制成0.5麦氏浊度的菌悬液，按照细菌微量生化鉴定管中使用说明，将菌悬液逐一滴加于甲基-α-葡萄糖苷、丙二酸盐、卫矛醇、吲哚的生化管中，每管接种3滴，将接种好的丙二酸盐、卫矛醇、吲哚的生化管于36 ℃，甲基-α-葡萄糖苷于30 ℃分别孵育24 h。每株菌进行2次平行的4项生化反应，孵育后进行结果判定。 1.3.3 基因组DNA提取

取适量的克罗诺杆菌培养物用试剂盒提取基因组DNA，并用核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度，A_260nm/A_280nm值在1.8~2.0之间的菌株基因组DNA，稀释至20 μg/mL备用。 1.3.4 参考菌株recN基因全长扩增

PCR扩增引物序列^[8]由上海生工生物工程公司合成。配制50 μL反应体系，其中10×buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL，Ex Taq(5 U/μL)5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，灭菌水补齐至50 μL。扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环，72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。 1.3.5 参考菌株PCR扩增产物检测及序列测定

利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，配制2 % 琼脂糖凝胶，取5 μL PCR产物加溴酚蓝混匀，以DL 2000 DNA ladder marker作为参照，120 V恒压电泳30 min。凝胶经溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统成像。每个参考菌株选择2个平行扩增阳性样品送上海生工生物工程公司进行正反双向测序。 1.3.6 克罗诺杆菌种间鉴定的recN基因片段筛选

用Lasergene软件将8个参考菌株测序序列分别与recN基因上的1 300 bp片段、934 bp片段(GenBank检索号FJ624474.1)、805 bp片段(GenBank检索号FJ624473.1)和640 bp片段进行比对并截取相应片段。用CLUSTALX1软件分别对参考菌株已截取好的4个不同recN基因片段进行全局比对，用MEGA 4.0软件按照N-J(neighbour-joining)法，基 于MCL(maximum composite likeliood)模型，分别对4个recN基因不同片段的参考菌株进行聚类，经bootstrap(1 000 次运算)检测聚类结果可信性。依据聚类结果，确定一段可将克罗诺杆菌鉴定到种且可信度最高、片段较短的recN基因片段，设计并合成该片段的扩增引物，用该引物对8个参考菌株进行扩增，并用琼脂糖凝胶电泳验证引物的有效性。 1.3.7 克罗诺杆菌分离株的种间鉴定

用设计合成的recN目的片段的引物，对44株克罗诺杆菌分离株进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，选择2个阳性平行样品进行测序。截取测序序列recN基因上的目的片段，以8个参考菌株作为参照，用MEGA 4.0软件对44株克罗诺杆菌分离菌株目的片段进行聚类分析，生成聚类图，根据聚类关系将44株克罗诺杆菌分离菌株鉴定到种。 2 结 果 2.1 实验菌株生化反应鉴定结果

经鉴定，8株克罗诺杆菌参考菌株的4项生化反应结果与参考文献^[8]一致，44株克罗诺杆菌分离菌株中有3株丙二酸盐阳性克罗诺杆菌，3株苏黎世克罗诺杆菌，37株阪崎克罗诺杆菌，编号10403.23的菌株经2次平行实验，丙二酸盐生化反应结果一次呈阳性，一次呈阴性，无法准确判定。为进一步确认该菌株的种，进行补充生化实验，最终判定其为尤尼沃斯克罗诺杆菌。 2.2 参考菌株recN全长基因扩增及测序(图 1)

8株参考菌株在1 800 bp处显示出清晰明亮的特异性目的条带，表明实验菌株的目的基因片段扩增成功；每株菌选择2个阳性平行样品用于测序，8株克罗诺杆菌参考菌株得到的测序片段长度均在1 400 bp左右，测序信号好，无双峰现象，2个平行样品测序结果一致，可用于克罗诺杆菌的聚类分析。

图 1

注：M：DL2000 DNA ladder marker；1~2：丙二酸盐阳性克罗诺杆菌；3~4：苏黎世克罗诺杆菌；5~6：都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种；7~8：都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种；9~10：都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种；11~12：尤尼沃斯克罗诺杆菌；13~14：阪崎克罗诺杆菌；15~16：穆汀斯克罗诺杆菌；C空白对照(ddH2O)。 图 1 8株克罗诺杆菌参考菌株recN全基因扩增结果

基于recN基因上1300、934、805和640 bp片段对8个参考菌株进行聚类，4个不同片段的聚类得到的8个标准菌株在不同进化支上均可被区分开，聚类结果基本一致，但640 bp片段聚类结果的各分支可信度均较高，故本研究最终选择640 bp片段(GenBank检索号EU569492.1基因上117~756 bp)对克罗诺杆菌进行种间鉴定。 2.4 640 bp recN基因片段的引物有效性验证(图 2)

根据640 bp片段在recN基因上的位置和序列，设计并合成扩增该片段的引物(上游引物recN640F：5′-GACTTTAACGCCGGGATGAC-3′，下游引物recN640R：5′-TCAAGCATATTCAGCACGCC-3′)，扩增片段长758 bp，包含recN基因上640 bp分析片段。用该引物对8个参考菌株扩增，结果显示，8个克罗诺杆菌参考菌株均在750 bp左右显示出清晰明亮的特异性目的条带，表明已成功对标准菌株的目的基因片段进行扩增，所设计的引物有效且特异性较好。

图 2

注：M：DL2000 DNA ladder marker；1~2：丙二酸盐阳性克罗诺杆菌；3~4：苏黎世克罗诺杆菌；5~6：都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种；7~8：都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种；9~10：都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种；11~12：尤尼沃斯克罗诺杆菌；13~14：阪崎克罗诺杆菌；15~16：穆汀斯克罗诺杆菌；C：空白对照(ddH2O)。 图 2 8株克罗诺杆菌参考菌株recN基因640 bp片段扩增结果

根据参考菌株在聚类图中的位置和遗传距离的远近，44株克罗诺杆菌分离菌株中37株是阪崎克罗诺杆菌，3株丙二酸盐阳性克罗诺杆菌，3株苏黎世克罗诺杆菌，1株尤尼沃斯克罗诺杆菌。其中，阪崎克罗诺杆菌是优势种，这与目前国际上对克罗诺杆菌的鉴定和分型结果一致^{[9, 10, 11]}。同一种内的菌株在不同进化分支上，遗传距离不同，提示克罗诺杆菌存在种内遗传多样性。基于recN 基因640 bp片段的44株克罗诺杆菌聚类结果与4项生化反应鉴定结果一致，编号10403.23的菌株，仅利用4项生化反应无法准确判定其所属的种，在进行补充生化反应后鉴定为尤尼沃斯克罗诺杆菌，基于recN 基因640 bp片段对分离菌株进行聚类即可以直接将其鉴定到尤尼沃斯克罗诺杆菌，聚类结果与生化鉴定结果吻合。

图 3

注：加粗的为8个参考菌株。 图 3 基于recN 640 bp基因片段的44株分离菌株聚类图

recN基因是克罗诺杆菌重组和修复蛋白基因，片段长1 665 bp，在克罗诺杆菌不同种之间存在差异。国外已有学者基于recN全基因序列对克罗诺杆菌进行聚类分析，将阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、尤尼沃斯克罗诺杆菌、苏黎世克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌以及都柏林克罗诺杆菌区分开，同时与肠杆菌科其他属进行了区分，但并未鉴定到都柏林克罗诺杆菌的亚种^[7]。1 665 bp片段较长，测序成本相对较高，本研究在此基础上建立的基于recN基因上的640 bp片段对克罗诺杆菌进行种间鉴定的方法，可信度较高，且成本较低。本研究所用的44株克罗诺杆菌分离菌株中阪崎克罗诺杆菌最多，可能与阪崎克罗诺杆菌在环境中分布较广，容易成为食品的污染源，而其余种是近几年刚被发现数量较少的新种有关，此外，对克罗诺杆菌检测和分析所用样品范围较窄，还不能包括克罗诺杆菌所有可能的污染源。因此，要进一步调查克罗诺杆菌不同种的分布情况，需扩大鉴定样品的种类和范围。聚类分析图显示，阪崎克罗诺杆菌被分在不同大分支上，该结果一定程度上反映了阪崎克罗诺杆菌是一个新的组合，且该种内遗传多样性很强，克罗诺杆菌属可能在以后被分离出更多的种，划分的更加详细。