近年来寻找探索一种或几种特异、敏感的生物标志物，早期诊断阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)，及时干预和治疗，使其不发生或延缓发生受到国内外学者重视^{[1, 2]}。本课题组在采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱仪研究筛选AD患者血清中生物标志物时发现L-谷氨酰胺(Lglutamine，LG)、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)和棕榈酰胺(palmitic amide，PA)与对照组有显著性差异。本文建立人血清中此标志物高效液相色谱质谱测定方法，为研究AD代谢通路和发病机制，早期诊断、预防和治疗提供科学依据。 1 对象与方法 1.1 对象

以黑龙江省海员总医院关怀病房的老年人为调查对象。其中阿尔茨海默病患者21人，对照组19人。 1.2 方法 1.2.1 样品采集

研究对象的确定：所有对象年龄≥60岁；阿尔茨海默病患者按照美国精神医学会的《精神障碍诊断和统计手册》第四版 ^[3]标准诊断痴呆，采用美国国立神经病语言障碍卒中研究所和阿尔茨海默病及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)标准^[4]诊断阿尔茨海默病患者。对照组为现场调查者访问和体检过程中未发现认知功能衰退或损害的征象，无脑卒中史、血管性痴呆、脑动脉硬化及严重心、肝、肺、肾脏器疾病者，简易精神状态量表(Mini-Mental State Examination，MMSE)^[5]测试成绩均在正常范围内。调查开始前与所有研究对象签署知情同意书，可自愿参加和退出。在采集调查对象血液样本前，按照中国营养学会发布的《中国居民膳食指南》^[6]，实行三天等热量标准膳食。利用真空负压采血管采集研究对象清晨静脉血3 mL，并在低温条件下带回实验室，置高速低温离心机中，在6 000 r/min转下离心10 min，取1.5 mL血清于EP管中，置-80 ℃深冻冰箱保存，待测。 1.2.2 实验方法 1.2.2.1 色谱质谱条件

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC^HSS T3 1.8 μm.2.1×100 mm Column，流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，色谱柱温度：35 ℃，分析过程采用线性梯度洗脱^[7]。质谱条件：离子源：电喷雾ESI，轰击电子能量70 Ev，正负离子模式采集数据；干燥气流速：12.0 L/min；毛细管电压：3 000 V；干燥气温度：350 ℃；雾化气压力：35 V；离子源温度：110 ℃；信号采集时选择sim定量，定性时选择scan；正负离子化模式质谱数据采集范围：30～600 u；脱溶剂气流：600 L/h。 1.2.2.2 标准溶液配制

配制浓度为2.25mg/mL的LG标准储备水溶液；浓度为1.0 mg/mL的PA标准储备乙醇溶液；浓度为1 mg/mL的LPC 标准储备1:1氯仿+甲醇溶液。混合标的配制：吸取上述单标溶液LG 0.2 mL、PA 0.4 mL、LPC 4.0 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，混均，其浓度为LG 45 μg/mL、PA 40 μg/mL、LPC 400 μg/mL。 1.2.2.3 测定血样：

取150 μL血清样品于EP管中，加300 μL甲醇沉淀蛋白，混匀，置低温高速离心机，12 000 r/min下离心10 min，上清液吸出置另一EP管，用氮吹仪吹至尽干，后用乙腈+水＝1+2溶液复溶，涡旋，12 000 r/min离心10 min，取上清液备测。取适量血清样品置4 mL刻度定量管中，加入混合标准溶液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mL，加血清样品至4 mL刻度，混均。然后按“1.2.2.1”项方法处理。经LC/MS分析，同时测定样品制备液。以质谱信息采集模式scan定性，选择离子监测sim定量。 1.3 主要仪器与试剂

高效液相色谱-质谱仪(Agilent Technologies 6120LC/MS)；自动进样器(Agilent Technologies G1329B)；KQ 600B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MS2型漩涡振荡器(德国IKA公司)；CR 21G型高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；Acrodisc GHP双性滤膜(美国Pall公司)；Milli Q超纯水器(美国Millipore公司)。标准物：L-谷氨酰胺(L-(+)-glutamine,LG)、棕榈酰胺(palmitic amide,PA)和溶血磷脂酰胆碱 [lysophosphatidylcholine(18∶0),LPC(18∶0)]，购于德国 Sigma 公司；乙醇、甲酸、氯仿、均为分析纯试剂，乙腈、甲醇为色谱纯，水为试验用超纯水。 1.4 统计分析

使用采用SPSS 13.0软件进行分析，所有计量数据以(x±s)表示，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 梯度洗脱的选择

3个组分中有2种组分LPC和PA的保留特性相似，因而在常规的等度洗脱条件下，难以在较短时间内使它们彼此完全分离，准确定量,虽然通过减少乙腈比例，延长保留时间有可能达到完全分离，但出峰慢，致使色谱峰展宽而影响定量。 2.2 标准曲线、检出限和定量下限(表 1)

实际血清样品中加混合标准液绘制标准曲线。以质量浓度(μg/mL)为横坐标x，测得的峰面积为纵坐标y进行线性回归；同时测定定量离子信噪比，以信噪比3倍时的溶液浓度为最低检出限；以信噪比10倍时的溶液浓度为定量下限。结果表明，血清样品中LG、PA、LPC呈较好的线性关系，相关系数均大于0.996 4；定量下限均小于1.51。

表 1

表 1 标准曲线的线性方程、相关系数和检出限、定量下限 化合物 保留时间(Min) 曲线方程 线性范围(μg/mL) 相关系数 检出限(μg/L ) 定量下限(μg/L ) LG 0.54 y=93 029x+44 698 0.56～4.50 0.998 7 0.22 1.42 PA 13.09 y=12 886x-835.0 0.25～4.00 0.996 4 0.18 1.51 LPC 13.73 y=42 205x-44 757 2.50～40.00 0.998 0 0.19 1.35

表 1 标准曲线的线性方程、相关系数和检出限、定量下限

吸取7份AD血清样本150 μL，每份中加入各标准溶液高、中、低三个浓度。LG：0.028、0.113、0.450 μg/mL；PA:0.025、0.100、0.400 μg/mL；LPC：2.500、10.000、20.000 μg/mL。

表 2

表 2 血清样品中LG、PA、LPC测定的精密度与准确性 化合物 样品本底 (μg/mL) 加标量 (μg/mL) 回收率 (%) 相对标准偏差 (%) LG 0.412 0.028 90.1 4.7 0.113 96.4 3.6 0.450 101.6 3.9 PA 0.615 0.025 88.6 3.3 0.100 97.7 4.2 0.400 93.2 2.9 LPC 11.060 2.500 86.7 4.4 10.000 100.5 3.7 20.000 95.8 4.6

表 2 血清样品中LG、PA、LPC测定的精密度与准确性

AD患者血清中各待测物浓度范围LG：0.46～1.89 mg/L，PA：0.70～0.89 mg/L；LPC：11.06～17.80 mg/L。健康老年人血清中各浓度范围LG：2.16～3.78 mg/L，LPC：PA：0.02～0.29 mg/L；20.10～48.39 mg/L。AD患者与对照组血清中LG、PA、LPC水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。 3 讨 论

目前已见利用高效液相色谱法测定人代谢物的研究^{[8, 9]}，本研究建立了高效液相色谱-质谱检测人生物样品血清中L-谷氨酰胺、溶血磷脂酰胆碱和棕榈酰胺含量的理想方法。利用该方法发现AD患者与对照组血清中LG、PA 、LPC水平差异具有统计学意义，与课题组前期试验结果相符。试验提示：血清中LG、PA 、LPC水平可能与AD认知功能障碍和记忆损害的发生和发展有关。因此，LG、PA 、LPC对神经细胞和大脑细胞间传递信息的机制，改善认知功能，增强记忆力的作用需进一步研究和验证。为AD的早期诊断、预防干预、早期治疗提供科学依据。本文所述方法样品前处理只经醇沉蛋白，高速离心，氮气吹干，乙腈定容。直接用滤膜过滤即可进样检测，待测组分经梯度洗脱能够在短时间有效分离，不仅可以大大加快分析速度，而且峰形也好，定量分析结果准确。且样品测定的回收率、重现性较好，具有准确、可靠，灵敏度高、分析周期短等优点，适用于阿尔茨海默病患者中血清中L-谷氨酰胺、溶血磷脂酰胆碱和棕榈酰胺水平检测和研究。