壬基酚是一种环境激素，能破坏干扰机体内分泌系统，因此又名内分泌干扰素^[1]。作为一种表面活性剂，壬基酚被广泛应用于化学洗涤剂中，随着洗涤剂在日常生活中的大量使用，壬基酚的安全性也越来越受到人们的关注^[2]。研究发现，较低剂量的壬基酚对雄性大鼠前列腺有增生作用^[3]。良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是男性老年人的常见病、多发病，但其病因和发病机制尚不十分明确，近年来，许多学者从细胞凋亡的角度去研究BPH的发病机制，并发现细胞凋亡的减少可导致BPH的发生^[4]。本研究旨在探讨不同剂量的壬基酚对大鼠前列腺组织细胞凋亡影响，并从凋亡基因(caspase-3、caspase-8、caspase-9)mRNA的表达角度进行机制探讨。结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

壬基酚(纯度99.9%，美国Sigma公司)；橄榄油(上海国药集团化学试剂有限公司)。焦磷酸二乙酯(上海晶美生物工程有限公司)，引物序列及目标片段，β-actin：上游：5′-CGTTGACATCCGTAAAGA-3′，下游：5′-AGCCACCAATCCACACAG-3′，173 bp;Caspase-3：上游：5′-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3′，下游：5′-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3′，147 bp；caspase-8：上游：5′-TCAGCAACATGCGGGACAG-3′，下游：5′-TGAAGCAGTCTTTGCCCTTGTG-3′，171 bp；Caspase-9：上游：5′-CTGAGCCAGATGCTGTCCCATA-3′，下游：5′-CCAAGGTCTCGATGTACCAGGAA-3′，168 bp；引物设计与合成、PrimeScriptTM RT Reagent、SYBR Premix Ex Taq试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；Tunel试剂盒(南京建成生物有限公司)。OLYMPUS-BioReporter图像拍摄系统和Image-Pro Plus 5.0图像分析软件(日本Olympus公司)；Hu-12A 型透射电子显微镜(日本日立公司)；7500型PCR仪(美国ABI公司)。 1.2 实验动物

健康清洁级Wistar雄性大鼠(上海实验动物研究中心)50只，体重135～154 g，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。大鼠经过1周适应性喂养，随机分为5组，每组10只，即对照组(橄榄油)及12.5、25、50、100 mg/kg壬基酚染毒组，采用皮下注射途径染毒，注射体积为1 mL/kg，连续染毒30 d。染毒期间，观察大鼠一般情况，包括外观，反应，食欲，活动等情况，并每天称重记录。染毒结束后，采集大鼠前列腺前叶组织待测。 1.3 指标与方法 1.3.1 Tunel法检测细胞凋亡

大鼠前列腺前叶组织常规固定包埋后，按试剂盒说明进行操作，用图像拍摄系统与图像分析软件计算前列腺组织细胞凋亡数，苏木素伊红(hematoxylin eosin，HE)染色计算前列腺中同一视野的细胞总数目，两者比值为凋亡率。 1.3.2 Caspase-3、caspase-8、caspase-9基因表达检测

采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time reverse polymerase chain reaction，RT-PCR)法，常规方法提取前列腺前叶组织RNA后，按试剂盒说明进行操作。扩增条件：采用两步法PCR反应程序。第1步94 ℃预变性10 s；第2步PCR反应，94 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。反应结束后，所有反应信息资料备ABI 7500扩增仪收集并储存，结合融解曲线进行分析。 1.4 统计分析

数据采用x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK(Student-Newman-Keuls)检验。检验水准为α=0.05。 2 结 果 2.1 一般毒性

在整个实验过程中，除100 mg/kg壬基酚染毒组大鼠实验后期活动明显减少、反应较迟钝、进食饮水略减、皮毛质地较差外，其余各组大鼠食欲、活动正常、皮毛光滑。 2.2 壬基酚对大鼠前列腺前叶组织细胞凋亡率影响

对照组及12.5、25、50、100 mg/kg 壬基酚染毒组大鼠前列腺前叶组织细胞凋亡率分别为(12.73±2.19)%、(3.07±1.31)%、(5.21±1.47)%、(6.31±1.29)%、(8.90±0.18)%，与对照组比较，各壬基酚染毒组大鼠前列腺前叶细胞凋亡率均下降(P<0.05)；但随着染毒剂量增加，前列腺上皮细胞凋亡率有增加趋势。 2.3 壬基酚对大鼠前列腺前叶组织细胞凋亡病理影响(图 1)

对照组大鼠前列腺上皮腺腔规则，细胞呈单层立方上皮，凋亡阳性细胞数目最多(细胞核蓝黑色为阳性)；而各壬基酚染毒组大鼠前列腺上皮细胞肥大，有些表现为复层，腺腔欠规则，阳性细胞数目较少；但随着染毒剂量增加，阳性细胞数有增加趋势。

图 1

注：A：对照组；B~E：12.5、25、50、100 mg/kg壬基酚染毒组。 图 1 壬基酚对大鼠前列腺组织细胞凋亡影响(HE染色，×400)

与对照组比较，各壬基酚染毒组caspase-3、caspase-8和caspase-9 mRNA表达均下降，但随着染毒剂量增加，caspase基因家族mRNA表达呈增加趋势。

表 1

表 1 壬基酚对大鼠前列腺组织凋亡相关基因mRNA表达影响(x±s，n=10) 组别(mg/kg) caspase-3 caspase-8 caspase-9 对照组 0.925±0.206 0.507±0.255 0.814±0.282 壬基酚 12.5 0.405±0.091b 0.215±0.106b 0.417±0.069b               25 0.430±0.115b 0.213±0.162b 0.588±0.266b               50 0.693±0.120a 0.341±0.138a 0.641±0.259a               100 0.721±0.127a 0.418±0.230a 0.717±0.903a 与对照组比较，a P<0.05,b P<0.01。

表 1 壬基酚对大鼠前列腺组织凋亡相关基因mRNA表达影响(x±s，n=10)

BPH是影响老年男性健康的常见疾病，发病率占老年男性疾病首位。研究表明，50岁男性的发病率>50%，>80岁的男性中>80%会出现组织学BPH^[5]，但其发病原因至今尚未阐明。细胞凋亡在前列腺增生的发生发展过程中作用已为人们初步认识，并发现了很多相关基因^[6]，caspase-8与caspase-3在caspase级联反应中分别在起始者与执行者上处于核心地位，是细胞凋亡发生的关键步骤及一切凋亡信号传导的共同通路。作为效应分子的caspase-3的活化主要依靠caspase-9 的激活^[7]。本研究结果显示，各壬基酚染毒组大鼠前列腺上皮细胞凋亡率下降，caspase-3、caspase-8和caspase-9 mRNA表达皆低于对照组(P<0.05)，提示在较低剂量作用下，壬基酚可引起大鼠前列腺组织细胞凋亡减少,其机制可能与壬基酚减少caspase-8和caspase-9基因表达，而致效应分子caspase-3基因表达下降，最终导致大鼠前列腺细胞凋亡减少有关；本研究结果还显示，随着染毒剂量增加，各壬基酚染毒组大鼠前列腺上皮细胞凋亡率及caspase基因表达皆有增加趋势，这可能与毒物的兴奋效应有关，即低剂量时表现为适当的刺激反应，而高剂量则表现为抑制作用^[8]，但壬基酚致大鼠前列腺组织细胞凋亡的具体机制尚有待进一步研究。