锌离子(Zn²⁺)是大气污染细颗粒物的主要水溶性金属成分^[1]，研究表明，长期吸入空气中含锌颗粒物与当地居民呼吸系统炎症性疾病的发病率升高有密切关系^[2]。气管灌注含锌化合物，可导致大鼠以中性粒细胞及蛋白渗出为主的呼吸道炎症^[3],但机制尚不清楚。环氧化酶2(cycloxygenase 2,COX-2是催化花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，COX-2表达水平升高已证实与慢性炎症有关^{[4, 5]}。COX-2基因的启动子序列上游包括1个保守的启动子序列TATA盒和一些与早期应答相关的顺式作用元件，其中包括核转录因子(nuclear factor kappa B，NFκB)位点，激活蛋白-1(activator protein-I,AP-1)位点等^[6]。不同刺激因子可诱导不同转录因子结合于不同的调控位点，促进COX-2转录，COX-2的诱导表达机制与刺激因子的种类和细胞组织特性有关^[7]。为此，本研究以永生化人支气管上皮细胞株BEAS-2B作为体外模型，观察锌离子对细胞内COX-2的诱导表达及AP-1 的转录调节作用。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

硫酸锌、Triton X-100、聚丙稀酰胺(美国Sigma公司)，角化细胞生长培养液(keratinocyte growth medium,KGM)(美国Clonetics公司)，RNA提取试剂 (美国Invitrogen公司)，TaqMan master mix(美国Perkin-Elmer公司)，莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)逆转录酶(美国Life Technologies公司)，Fugene 6转染试剂(瑞士Roche公司)，染色质免疫沉淀(ChIP)试剂盒(美国Upstate公司)，AP-1亚单位c-Jun抗体(美国Cell Signaling公司)，ABIPrism 7700 Sequence Detector(美国Applied Biosystems公司)，Gene Gynome Imagine System(美国Syngene公司)，AutoLumat LB953 luminometer (德国Berthold 公司)。 1.2 细胞与培养

BEAS-2B (S6)(美国ATCC公司)，细胞培养液为KGM，细胞在37 ℃、5% CO₂培养箱内培养，乙二胺四乙酸-胰酶消化、传代。 1.3 COX-2的转录表达

采用real-time PCR法，引物及TaqMan 荧光探针序列设计如下：COX-2扩增片段67 bp，上游引物：5′- GAATCATTCACCAGGCAAATT G -3′，下游引物：5′- TCT GTA CTG CGG GTG GAA CA -3′，探针：5′- TCC TAC CAC CAG CAA CCC TGC CA -3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)扩增片段226 bp，上游引物：5′- GAA GGT GAA GGT CGG AGT C -3′，下游引物：5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC - 3′，探针：5′- CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC -3′。用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)将硫酸锌配成0(对照组)、12.5、25.0、50.0 μmol/L溶液，分别刺激BEAS-2B细胞8 h，收集细胞，加入Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。PCR扩增条件为：反应终体积为50 μL，反应体系包含TaqMan master mix、1.25 μmol/L荧光探针、3 μmol/L上、下游引物。PCR运行参数为：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40 个循环。COX-2mRNA的表达水平用GAPDH表达量进行标化。 1.4 AP-1与COX-2的结合作用测定

将BEAS-2B细胞接种在100 cm²培养瓶中，培养至对数生长期加入50.0 μmol/L硫酸锌溶液并温育8 h，甲醛固定，参照试剂盒说明书方法进行ChIP实验，PBS漂洗后，裂解细胞，收集裂解液超声破碎。用salmon sperm DNA/protein A agarose 清除染色质里非特异性抗体，取上清分别加入c-jun 抗体和阴性对照IgG抗体，同时加入salmon sperm DNA 和 protein G-Sepharose beads，孵育2 h。用低盐、高盐洗液及氯化锂洗液依次清洗beads，进行蛋白质DNA复合物的洗脱及DNA的去交联和纯化。取2 μL DNA模板用COX-2启动子区特异性引物进行PCR扩增，PCR反应扩增条件：95°C，2 min，95°C，30 s，55°C，30 s，72°C，30 s，35个循环。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。Input DNA 是清除了染色质中非特异性的抗体后直接进行去交联和纯化的基因组DNA，作为阳性对照。 1.5 COX-2转录活性检测

克隆人COX-2基因启动子及AP-1结合位点突变的启动子，与β-半乳糖苷酶报告基因载体(pSV-β-galactosidase，β-gal)重组构建(美国北卡罗来纳大学环境医学研究所赠送)。将BEAS-2B细胞接种到24 孔细胞培养板内，至细胞增长至40%~50%融合时，利用Fugene6转染试剂分别将β-gal与COX-2启动子区AP-1结合位点突变的质粒pAP-1-luc(荧光素酶基因)共同转染到BEAS-2B 细胞内。每孔内加入1.2 μL Fugene6转染液、0.2 μg β-gal及0.2 μg pAP-1-luc，并以野生型的启动子荧光素酶报告质粒作为对照。培养24 h，加入50.0 μmol/L锌溶液温育8 h，PBS洗2次，裂解细胞。收集细胞裂解液，按Luciferase Assay System的说明书测定裂解液中基因荧光强度。COX-2的转录活性以荧光素酶的荧光强度和β-gal的荧光强度比值表示。 1.6 统计分析

数据以(x± s)表示，应用SPSS 12.0统计软件进行统计分析。采用单因素方差分析比较各组BASE-2B细胞中COX-2mRNA表达水平，两两比较采用最小显著差法检验；转录活性的比较采用t检验。检验水准α=0.05。 2 结 果 2.1 锌离子对BEAS-2B细胞COX-2转录影响

对照组、12.5、25.0、50.0 μmol/L Zn⁽²⁺⁾组BEAS-2B细胞中COX-2mRNA相对表达量分别为(0.16±0.02)、(0.14±0.06)、(0.17±0.06)、(1.23±0.16);与对照组比较，50.0 μmol/L Zn⁽²⁺⁾组BEAS-2B细胞中COX-2的mRNA表达量升高7.68倍(P＜0.05)。 2.2 AP-1与COX-2的结合作用验证(图 1)

在50.0 μmol/L硫酸锌刺激8 h时，COX-2启动子可和AP-1亚单位c-Jun特异性结合，提示在锌离子刺激下转录因子AP-1可结合于COX-2启动子，从而促进COX-2转录。

图 1

注：Ct：对照组;Zn(2+):50.0 μmol /L硫酸锌组。 图 1 外源性锌诱导COX-2启动子与AP-1结合

在50.0 μmol/L硫酸锌刺激8 h时，COX-2启动子区AP-1结合位点突变质粒和野生型质粒转染的BEAS-2B细胞内荧光素酶的活性分别为(1.71±0.33)、(9.19±2.02)，差异有统计学意义(t＝6.321，P<0.05)。COX-2基因启动子区AP-1结合位点突变可使锌离子所致的(COX-2)高转录活性降低82%，提示AP-1在锌离子诱导的COX-2转录活性中具有重要调控作用。 3 讨 论

环氧化酶(cycloxygenase,COX)有COX-1、COX-2、COX-3 3种同工酶。COX-1是一种持续表达的结构酶，发挥看家作用，主要调节生理性前列腺素合成；COX-3是一种新型剪接异构体，与COX-1源于同一基因，主要在心、脑组织持续表达；COX-2又称诱导型环氧化酶，在正常生理状态下多数组织中不表达或者低表达，但可在生长因子、内毒素及肿瘤促进因子诱导下产生，是一种早期应答基因，属于炎症相关酶^[8]。

COX-2作为在炎症发生中具有重要作用的因子，其调控机制尤为重要。各种刺激因子可通过不同的信号转导通路作用于COX-2启动子调控序列，促进COX-2转录，COX-2的诱导表达机制与刺激因子的种类和细胞组织特性有关。成纤维细胞L929在肿瘤坏死因子α刺激下可通过鞘氨醇激酶信号诱导COX-2的表达；表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)对关节软骨细胞中的COX-2的诱导表达是通过细胞外调节蛋白激酶和p38丝裂原激活蛋白激酶信号通路进行调控^[9]。本研究结果显示，锌离子刺激可提高BEAS-2B细胞COX-2的mRNA表达，而且锌离子刺激可使AP-1与COX-2启动子结合，当COX-2启动子区AP-1结合位点突变时可降低锌离子所致的转录活性，提示转录因子AP-1对锌离子所诱导的COX-2转录表达具有重要的调控作用。