中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (5): 623-625   PDF    
引用本文
智霞萍, 王素萍. 军团菌感染与2个细胞因子基因多态性关系[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(5): 623-625.
ZHI Xia-ping, WANG Su-ping. Relationship between gene polymorphisms of TNF-α and IL-1 β 2 gene locus and Legionella infection[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(5): 623-625.
军团菌感染与2个细胞因子基因多态性关系
智霞萍1, 王素萍2     
1. 太原市第四人民医院院感科, 山西030053;
2. 山西医科大学公共卫生学院
数字出版日期: 2010-11-29.
基金项目: 国家自然科学基金(30872154);教育部高等学校博士学科点专项科研基金课题(20040114004)
作者简介: 智霞萍(1978- ),女,山西榆次人,医师,硕士,研究方向:传染病分子流行病学.
通讯作者: 王素萍,E-mail:spwang88@163.com
摘要: 目的 探索肿瘤坏死因子-α(TNF-α)-308位点、白介素-1 β(IL-1 β)-511位点基因多态性与军团菌感染的关系.方法 将32例军团菌感染者作为病例组,随机抽取100例军团菌检测阴性的肺部感染者为患者对照组,同期收集70例健康体检者为健康人对照组,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测3组TNF-α基因-308位点、IL-1 β基因-511位点的单核苷酸多态性.结果 病例组TNF-α-308基因型GG、GA、AA分别占75%、25%、0%,患者对照组GG、GA、AA基因型分别占87%、13%、0%,健康人对照组GG、GA、AA基因型分别占68.6%、31.4%、0%;病例组与患者对照组比较、病例组与健康人对照组比较,TNF-α-308位点基因型和等位基因频率差异无统计学意义(χ2=0.437、0.362,P=0.509、0.548;χ2=2.609、2.384,P=0.106、0.123);病例组IL-1 β-511基因型CC、CT、TT分别占:0%、53.1%、46.9%,患者对照组CC、CT、TT基因型分别占3.4%、48.3%、48.3%,健康人对照组CC、CT、TT基因型分别占10%、51.4%、38.6%,3组比较,IL-1 β-511位点基因型和等位基因频率差异无统计学意义(χ2=4.466,P=0.334;χ2=2.420,P=0.298).结论 TNF-α-308位点、IL-1 β-511位点的基因多态性与军团菌感染无关,TNF-α基因和IL-1 β基因不是军团菌感染的易感基因.
关键词: 军团菌     肿瘤坏死因子-α     白介素-1 β     单核苷酸多态性    
Relationship between gene polymorphisms of TNF-α and IL-1 β 2 gene locus and Legionella infection
ZHI Xia-ping1, WANG Su-ping2     
Department of Infectious Disease, The Forth People's Hospital of Taiyuan City, Taiyuan 030053, China
Abstract: Objective To explore the the relationship between gene polymorphisms of TNF-α-308 G/A and IL-1 β-511 C/T and Legionella infection.Methods Thirty-two individuals infected with Legionella were selected as case group and 100 other pulmonary disease patients with negative Legionella test were selected as and control group by randomized sampling,and 70 healthy individuals having health examination in the same period were chosen as another control group.The tumor necrosis factor-α(TNF-α)-G308A and interlenki-1 β(IL-1 β)-C511T gene polymorphisms were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Results In case group,the frequency of GG,GA,and AA of TNF-α-308 was 75%,25%,and 0% in the disease control group,the frequency of GG,GA,and AA and 87%,13%,and 0% ;in the healthy control group,the frequency of GG,GA,and AA was 68.6%,31.4%,and 0%.There was no statistical difference for the TNF-α-G308A genotype and allele frequencies between case group and control groups(χ2=0.437,0.362,P=0.509,0.548;χ2=2.609,2.384,P=0.106,0.123).In case group,the frequency of CC,CT,and TT of IL-1 β-511 was 0%,53.1%,and 46.9% ;in the disease control group,the frequency of CC,CT,and TT was 3.4%,48.3%,and 48.3% ;in the healthy control group,the frequency of CC,CT,and TT was 10%,51.4%,and 38.6%.There was no statistical difference for the IL-1 β-C511T genotype and allele frequencies between three groups(χ2=4.466,2.420,P=0.334,0.298).Conclusion The gene polymorphisms of TNF-α-G308A and IL-1 β-C511T was not associated with Legionella infection.TNF-αgene and IL-1 βgene may be not the predisposing genes of Legionella infection.
Key words: Legionella     tumor necrosis factor-α     interleukin-1 β     single nucleotide polymorphism    

军团菌病是近30年来新发现的传染病,其暴发常以群体发热和非典型肺炎为特征。人群主要通过吸入含有军团菌的气溶胶而感染,传播途径易于实现,易形成暴发流行〔1, 2〕,是防制突发公共卫生事件不可忽视的重要问题。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1 β(interleukin-1 β,IL-1 β)是启动炎症反应的关键细胞因子,动物实验和体外试验研究结果显示,TNF-α及IL-1 β对于机体抗军团菌感染有重要作用〔3, 4〕。本研究观察了这2个细胞因子的基因多态性与人群军团菌感染的关联性,现将结果报告如下。

1 对象与方法 1.1 对象

收集2007年7月-2009年1月山西医科大学第一医院、太原市中心医院、武警山西总队医院3所医院肺部感染患者的血液标本231份,采用微量凝集试验检测血清中嗜肺军团菌血清型1(Lp 1)特异性抗体(血清抗体滴度≥1:256为阳性),检出阳性16例;收集患者新鲜痰液86份,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增痰液中军团菌属特异性16 SrRNA基因,扩增阳性16例。将32例军团菌感染阳性者作为病例组;随机选取同期军团菌检测阴性的其他肺部感染者100例,作为患者对照组;在同一医院健康体检者中随机选取70人,作为健康对照组。3组对象均排除结核菌感染者、乙型肝炎病毒(HBV)阳性者、人类免疫缺陷型病毒(HIV)阳性者。标本采集及参加实验均经患者知情同意并签署患者知情同意书。病例组与对照组性别与年龄差异无统计学意义(χ2分别为1.425、1.060;P > 0.05),组间均衡性较好。

1.2 方法 1.2.1 基因组DNA及引物

采集3组对象静脉血各2 mL,采用氛-氯仿法提取血液中基因组DNA,-20℃保存。参考文献〔5, 6〕,根据TNF-α及IL-1 β基因序列及SNP位点,合成特异性引物,经Genebank核对无误。引物合成由大连宝生物工程有限公司完成。引物序列如下:(1) TNF-α-308〔5〕:5'-AGGCAATAGGTTTTTGAGGGCCAT-3',5'-TCCTCCCTGCT CCGATTCCG-3',扩增片段长度为107 bp;(2) IL-1 β-511〔6〕:5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3',5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3',扩增片段长度为304 bp。

1.2.2 PCR扩增体系与程序

(1) TNF-α-308位点:扩增体系50 μL,包括10 × PCR Buffer 5 μL,4 × dNTP 4μL,MgCl2 3 μL,Taq DNA聚合酶2U,上下游引物各1 μL,DNA模板5 μL,灭菌双蒸水30.6 μL。扩增程序:95℃预变性5 min后,进行30个循环,每个循环条件为95℃变性50 s,56℃退火50 s,72℃延伸50 s,30个循环后再延伸10 min。(2) IL-1 β-511位点:扩增体系25 μL,包括10 × PCR Buffer 2.5 μL,4 × dNTP 2 μL,MgCl2 1.5 μL,Taq DNA聚合酶2U,上下游引物各0.5 μL,DNA模板2.5 μL,灭菌双蒸水15.1 μL。扩增程序:95℃预变性5 min后,进行30个循环,每个循环条件为95℃变性50 s,50℃退火50 s,72℃延伸50 s,30个循环后再延伸7 min。(3)结果判定:PCR扩增结束后,用2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,观察PCR扩增片断图谱。扩增到与预期目的片断大小一致的条带的标本判定为阳性。

1.2.3 扩增产物限制性酶切

取PCR扩增产物10 μL进行酶切。(1) TNF-α-308位点:酶切体系为20 μL,其中DNA扩增产物10 μL,10 × K buffer 2 μL,NcoI内切酶10 U,0.1% BSA 2 μL,灭菌水5 μL。(2) IL-1 β-511位点:酶切体系为20 μL,其中DNA扩增产物10 μL,10 × NEB缓冲液2 μL,Ava I内切酶5 U,灭菌水7.5 μL。酶切反应结束后,分别采用3%和2%的琼脂糖凝胶电泳观察基因型和等位基因。

1.3 统计分析

应用SPSS 13.0软件进行统计分析,基因型和等位基因频率采用直接计数法,各组基因型和等位基因频率差异比较采用χ2检验。

2 结果 2.1 两个位点基因型鉴定(图 1、2)

(1) TNF-α-308位点:扩增到与目的片断一致的条带,长度为107 bp。经酶切后,TNF-α基因-308位点野生型G被酶切为87、20 bp 2个片段,属于GG纯合子基因型;突变型A不能被酶切,只有1个107 bp片段,属于AA纯合子基因型;被酶切为107、87、20 bp 3个片段者属于杂合子GA基因型(图 1)。(2) IL-1 β-511位点:扩增到与目的片断一致的条带,长度为304 bp,经酶切后,IL-1 β基因-511位点野生型C被酶切为190、114 bp 2个片段,属于纯合子CC基因型;突变型T不能被酶切,只有1个304 bp片段,属于纯合子TT型;被酶切为304、190、114 bp 3个片段者属于杂合子CT基因型(图 2)。

注:1: DNA marker; 2 ～ 17: GG 纯合子基因型; 18: GA 杂合子基因型。 图 1 TNF-α-308 位点基因多态性电泳图谱

注:1:DNA marker;2、6、7、9:TT纯合子基因型;3~5、8、10:CT杂合子基因型;11:CC纯合子基因型。 图 2 IL-1 β-511 位点基因多态性电泳图谱
2.2 基因型和等位基因频率分布(表 1、2)

(1) TNF-α基因-308位点:结果显示,病例组、患者对照组、健康对照组3组TNF-α基因-308位点基因型和等位基因频率差异有统计学意义(χ2=8.659、7.627,P=0.013、0.022),病例组、患者对照组GG基因型和G等位基因频率高于健康对照组,但病例组与其他2组两两比较差异无统计学意义(与健康对照组比较,χ2=0.437、0.362,P=0.509、0.548;与患者对照组比较χ2=2.609、2.384,P=0.106、0.123);患者对照组GG基因型和G等位基因频率高于健康对照组,差异有统计学意义(χ2=8.553、7.572,P=0.003、0.006)。(2) IL-1 β基因-511位点:结果显示,病例组、患者对照组TT基因型和T等位基因频率高于健康对照组,但差异均无统计学意义(χ2=4.466、2.420,P=0.334、0.298)。

表 1 TNF-α基因-308位点基因型和等位基因分布

表 2 IL-1 β基因-511位点基因型和等位基因分布
3 讨论

TNF-α-308位点的基因多态性与疾病间关系研究结果不尽一致。Danilo等〔8〕认为此位点多态性与麻风病易感性有关,有GG基因型的人更易患麻风病。张平安等〔9〕的研究显示乙型肝炎患者TNF-α的GG基因型明显高于正常对照组,提示TNF-α-308位A等位基因可能通过促进TNF-α基因转录,提高血中TNF-α含量而发挥其清除乙肝病毒功能。但另外的报道显示此位点的基因多态性与乙肝病毒的感染无关〔10〕。本研究结果显示,病例组与患者对照组、病例组与健康人对照组比较TNF-α-308位点基因型和等位基因分布频率差异无统计学意义,认为TNF-α-308位点基因多态性可能与军团菌感染无关。

IL-1 β被认为是感染性疾病发生发展和转归中起关键作用的介质之一。有关IL-1 β的基因多态性与感染性疾病的关系的报道并不多见。Hamajima等〔11〕研究显示,-511位点不同基因型个体间幽门螺杆菌(H.pylori,HP)感染发生率明显不同,C/C、T/C型个体的HP感染率也高于T/T型。裴凤艳〔12〕的研究显示IL-1 β-511位点T等位基因与结核的发病部位有关,且能减少肺结核空洞形成的风险性,OR为0.072~0.718。本研究结果显示,此位点的基因型和等位基因频率在军团菌感染者和肺部其他感染者以及健康人中差异无统计学意义。-511位点与-31位点高度连锁,是否IL-1 β不同位点间相互影响,共同影响疾病的易感性,尚需进一步研究。

目前,有关军团菌宿主易感性研究的报道很少,本次研究虽未能找出与军团菌感染有关的基因,但在这方面进行了相关探索,为今后的研究一定的基础。

参考文献
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