食管癌发病率在肿瘤中占第8位，恶性程度高，5年生存率＜ 10%^{〔1, 2〕}。中国是食管癌高发地区，以食管鳞癌为主，每年新增病例达25万，占全世界病例数的50%^〔3〕。目前食管癌确切的发病机制仍未阐明，但普遍认为食管癌是一种复杂的多基因疾病，是遗传因素和环境因素共同作用的结果。着色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum group D，XPD)，又称切除修复交叉互补基因2(excision repair cross-complementing rodent repair deficiency 2，ERCC2)，长约20 kb，定位于第19号染色体长臂13区3带，由23个外显子组成^〔4〕。XPD基因第10外显子312密码子G→A变异和第23外显子751密码子A→C变异是最常见的2个多态性位点。研究结果显示，312和751两个多态性位点存在连锁不平衡，其突变表型与DNA损伤修复能力密切相关^〔5〕。本研究采用病例对照研究方法，探讨XPD基因312位点和751位点多态性与河南汉族人群食管鳞癌易感性的关系，以及环境与基因多态性在食管鳞癌发生中的交互作用。

选取 2008 年 3 月—2010 年 1 月郑州大学第一附 属医院经组织病理学确诊为原发性食管鳞状细胞癌新发病例 235 例，均未接受过化疗和放疗。按性别和年龄( ± 5 岁) 与 病例进行 1: 1 匹配，选取河南省新乡县健康居民 235 名作为 正常对照组。病例组和对照组个体均为河南籍汉族且无直系 亲属关系; 所有研究对象均签署知情同意书。同时采集外周 血 5 mL，－ 80 ℃ 保存备用。

使用统一自行设计的《健康情况调查表》，由经过统一培训的调查员进行面对面调查，内容主要包括基本情况、吸烟饮酒史、肿瘤病史等。参照文献〔6, 7〕，每天吸烟 ≥1支，持续 ≥6个月定义为吸烟 ;每次饮白酒 ≥100 mg，每周饮 ≥1次，持续 ≥6个月定义为饮酒。

采用抗凝血 DNA提取试剂盒提取 DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法进行基因分型。( 1)引物序列 : XPD 312:上游 5'-CTG TTG GTG GGT GCC CGT ATC TGT TGG TCT-3';下游 5'-TAA TAT C GG GGC TCA CCC TGC AGC ACT TCC T-3'(注: TAA TA为降低引物 GC含量而引入的错配碱基，C为人为设计的酶切位点引入的错配碱基 )。XPD 751:上游 5'-GCC CGC TCT GGA TTA TAC G-3';下游 5'-CTA TCA TCT CCT GGC CCC C-3'。( 2) PCR扩增体系 : 15 μL，包括 2 × Taq PCR Plus Mas-ter Mix 7.5 μL，上下游引物各 0.4 μmol /L，模板 DNA 100 ng。( 3)扩增程序 : 312位点 : 95℃预变性 5 min;然后 95 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 35个循环 ;最后 72 ℃延伸 10 min，4℃保存。751位点 : 94 ℃预变性 2 min;然后 94 ℃变性 30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35个循环 ;最后 72 ℃延伸 7 min，4℃保存。各取 5 μL PCR扩增产物分别与限制性内切酶 StyⅠ和 PstⅠ于 37 ℃水浴过夜。

单体型 ( haplotype)是位于 1条染色体或某一区域的 1组具有关联性的单核苷酸多态等位位点，包含多个单核苷酸多态的遗传信息，检测单体型比单个单核苷酸多态可能具有更好效果^〔8〕。因此将基因分型结果导入单体型生物学分析软件( SNPHAP软件)，获得 XPD基因 2个多态性位点单体型预测值并进行比较。

采用 SPSS l3.0软件进行统计分析，采用 t检验或 χ²检验比较病例组和对照组基本情况的差异 ; Hardy-Weinberg平衡分析方法检验对照组基因型频率分布状况 ;采用 Logistic回归分析计算调整后比值比 ( OR)及其 95% CI。运用 SNPHAP软件进行 Haplotype(单体型 )预测，χ²检验比较单体型，以比值比 ( OR)及其 95% CI表示相对危险度 ;采用似然比检验判断基因与环境的交互作用 ;以上均为双侧检验，检验水准为 α = 0.05。

年龄、性别、吸烟和饮酒在病例组和对 照组的分布频率差异无统计学意义 (均 P＞ 0.05 ) ;病例组有肿瘤家族史比例为 14.04% ( 33 /235)，对照组为 4.26% ( 10 / 235)，差异有统计学意义 ( P＜ 0.01 )。对照组中 XPD基因 312位点和 751位点的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡( χ² =0.27，P＞ 0.05 )。

XPD 312位点扩增结果显示，野生基因型 GG为 507、244 bp2个片段 ;突变杂合基因型 GA为 507、474、244、33 bp4个片段 ;突变纯合基因型 AA为 474、 244和 33 bp3个片段，其中 33 bp片段长度太短，电泳图未能显示 (图 1)。XPD 751位点扩增结果显示，野生基因型 AA为 290、146 bp2个片段 ;突变杂合基因型 AC为 290、227、 146、63 bp4个片段 ;突变纯合基因型 CC为 227、146和 63 bp 3个片段，其中 63 bp片段长度太短，电泳图未能显示(图 2)。

图 1

注: M : 100 bp DNA Ladder; 1: GG基因型 ; 2: GA基因型 ; 3: AA基因型。 图 1 XPD基因 312位点电泳图谱

图 2

注: M : 100 bp DNA Ladder; 1: AA基因型 ; 2: AC基因型 ; 3: CC基因型。 图 2 XPD基因 751位点电泳图谱

表 1

表 1 食管癌易感性与 XPD基因 2个位点多态性关系比较

表 1 食管癌易感性与 XPD基因 2个位点多态性关系比较

与野生基因型 GG比较，XPD312位点杂合突变基因型 GA、纯合突变基因型AA和联合突变基因型( GA + AA)在 2组分布的差异无统计学意义 ;与野生等位基因 G比较，突变等位基因 A不是食管鳞癌的易感等位基因。与野生基因型 AA比较，XPD 751位点杂合突变基因型 AC、纯合突变基因型 CC和联合突变基因型 ( AC +CC)在 2组分布的差异无统计学意义;与野生等位基因 A比较，突变等位基因 C不是食管鳞癌的易感等位基因。

表 2

表 2 XPD基因 2个多态性位点单体型比较

表 2 XPD基因 2个多态性位点单体型比较

2个位点共 4种单体型，以 GA作为对照单体型，食管鳞癌易感性与 GC、 AA和 AC单体型无关，差异均无统计学意义。

以不吸烟的野生基因型携带者和不饮酒的野生基因型携带者为参照，进行分层分析。结果显示，吸烟、饮酒与 XPD 312和 XPD 751之间交互作用差异无统计学意义( P＞ 0.05 )。

本研究结果表明，XPD基因 312位点多态性与食管鳞癌的发生无关，与国内外有关报道一致^{〔9, 10, 11, 12, 13〕}。未发现 XPD基因 751位点多态性与食管鳞癌的相关性，这与国内部分有关研究结果一致^{〔9, 12, 14〕}，但与国内部分有关研究结果不一致^{〔10, 15〕}。2004年 Yu等^〔10〕研究表明，中国人携带 XPD基因 751位点突变纯合基因型 CC个体患食管癌风险增加; 2008年陈梦如等^〔15〕研究也表明，XPD基因 751位点多态性与男性食管癌遗传易感性有关。类似研究结果在国外人群中也存在矛盾现象。2005年 Casson等^〔16〕研究结果显示，XPD基因 751位点突变纯合基因型 CC个体可降低加拿大人群食管癌的发病风险，此后未发现有类似研究报道。2007年 Sobti等^〔17〕研究显示，在北印度人群中 XPD基因 751位点多态性与食管鳞癌的发病风险无关 ; 2008年 Ferguson等^〔18〕在欧洲人群中和 Doecke等^〔19〕在混合人群中均未发现 XPD基因 751位点多态性与食管腺癌的发病风险有关。而 2006年 Ye等^〔11〕研究表明，对于瑞典人群 XPD基因 751位点多态性增加了食管腺癌的发病风险，这与后来的 Tse等^〔13〕在 2008年的研究结果一致 ;与野生基因型 AA比较，携带杂合基因型 AC的个体是食管腺癌的危险因素。

这些研究结果不一致的原因是多方面的。( l)可能与研究对象的种族不同导致遗传背景差异有关，或者种族相同地区不同导致环境暴露差异有关。本研究报道河南地区汉族人群 XPD基因 751位点突变等位基因频率约为 23%，高于北京地区 ( 7% )、江苏地区 ( 11% )等研究结果^{〔9, 15〕};而白种人 XPD基因 751位点突变等位基因频率高达 42%^〔20〕;( 2)研究设计上存在缺陷，如 Casson等^〔16〕研究样本量较小，选取对照时未进行匹配，研究结果可能会受到混杂因素 (如性别、年龄、肿瘤病史等 )的影响 ; ( 3)可能 XPD基因与其他潜在基因发生交互作用所致。

研究表明，在与复杂性状的相关分析中单体型包含着多 个单核苷酸多态的遗传信息，因此采用单体型比单个单核苷 酸多态可能具有更好的统计分析效果^〔8〕。但本研究结果未 发现与食管鳞癌发生相关的单体型。周荣秒等^〔12〕的研究也 显示，3种单体型 GC、AA和 AC和食管鳞癌的发生无关。

本研究采用相乘模型对吸烟、饮酒和基因突变在食管癌 发生中的交互作用进行分析。结果显示，在食管鳞癌的发生 发展中，无论是吸烟还是饮酒均未发现与 XPD 312位点和 XPD 751多态性的交互作用，这与 Yu等^〔10〕和陈梦如等^〔15〕的 研究结果不一致。有待于大样本人群和更缜密的研究设计进 一步深入探讨。