猪链球菌( Streptococcus suis，S.suis)是重要的人畜共患病病原体，可致猪患脑膜炎、败血症、关节炎等病症;人类感染该菌，可致脑膜炎、败血症等，甚至导致病死率极高的链球菌中毒性休克综合症，严重危害人类健康^〔1,2,3〕。目前尚无可预防S.suis感染的有效疫苗。课题组前期研究制备了锌转运蛋白A(ZnuA)重组蛋白并发现该蛋白具有良好的免疫原性^〔4〕。本研究通过聚合酶链反应(PCR)检测znuA基因在不同血清型S.suis中的分布情况，对ZnuA蛋白进行细胞表面定位，观察重组ZnuA对Balb/c小鼠接种致死量2型猪链球菌(S.suis 2)菌株的免疫保护作用，为进一步研究S.suis 2亚单位疫苗奠定实验基础，现将结果报告如下。

98012、Habb为江苏患者分离株，05ZYH33为四川人源分离株，HA68为江苏猪源分离株(均为本实验室保存);7996和T15(荷兰Greeff教授惠赠);33株血清型标准参考株(加拿大Gottschalk教授惠赠);含表达质粒pET-32a: : znuA的E.coli BL21(DE3)宿主菌(本实验室保存)。

4周龄SPF级BALB/c小鼠20只，雌性， 体重13～14 g(军事医学科学院试验动物中心;动物合格证 号: SCXK-(军)2007-004)。

PCR扩增试剂盒(大连TaKaRa公司);DNA胶回收试剂盒(美国Promega公司);DNA marker、protein marker(美国Fermenta公司);弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(美国Sigma公司);辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司);diaminobenzidine(DAB)显色液(武汉博士德生物工程有限公司);底物O-phenylenedimaine(OPD)(南京大治生物技术有限公司);氨苄青霉素(ampicillin)和卡那霉素(kanamycin)(上海生物工程有限公司);其他试剂均为国产分析纯。

根据05ZYH33菌株的基因组中znuA基因序列^〔5〕设计合成引物。上游引物为5'-TCAGCTGCAACGAATCTTATC-3';下游引物为5'- TTAGTCCTTATCGGTTTCTT-3'，引物由上海赛百盛生物技术公司合成。分别以不同血清型S.suis标准株、7996、T15以及S.suis 2国内分离株基因组为模板，采用PCR扩增znuA基因，预计扩增目的片段大小为837 bp。PCR程序为94 ℃ 5min;94 ℃ 30 s;56 ℃ 1 min;72 ℃ 90 s，共26个循环，最后72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。

(1)05ZYH33菌体蛋白抽提:挑取S.suis 2 05ZYH33单菌落接种于5 mL Todd- Hewitt broth(THB)液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜。取细菌培养物1.5 mL，12000 r/min离心5 min，收集沉淀，超纯水洗涤3次。100 μL超纯水重悬，100 ℃水浴处理10 min。加入8 mmol/L尿素400 μL，10%SDS 400 μL，1 mmol/L二硫苏糖醇10 μL，4 ℃过夜处理。12 000 r/min离心5 min，收集上清。(2)蛋白免疫印迹Western blot:取抽提的05ZYH33细菌蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用电转印法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h后，加1∶ 10 000稀释的兔抗ZnuA蛋白的血清，4 ℃过夜，加1∶ 1 000稀释的HRP标记山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，加底物DAB/H₂O₂显色。

取10⁸菌落形成单位(cfu)的05ZYH33细菌，经0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗3次后，悬于100 μL PBS中，加入兔抗ZnuA蛋白的多抗血清(1∶ 100)，4 ℃静置1 h。0.01 mmol/L PBS洗3次后，悬于100 μL PBS中，并加入FITC-羊抗兔IgG(1∶ 50)4 ℃静置1 h。0.01 mmol/L PBS洗4次后，悬于500 μL PBS中，同时加入等量4%多聚甲醛固定30 min，流式细胞仪检测细菌荧光量。

ZnuA重组蛋白按文献^〔4〕制备，BALB/c小鼠20只分成实验组和对照组，每组10只。在接种05ZHH33菌株之前，实验组分3次注射ZnuA蛋白，对照组同步注射磷酸盐缓冲液(PBS)。免疫步骤如下:实验组每只小鼠皮下注射25 μg用弗氏完全佐剂乳化的ZnuA蛋白，每只100 μL。2周后，皮下注射25 μg用弗氏不完全佐剂乳化的ZnuA蛋白，每只100 μL。1周后，皮下注射25 μg用弗氏不完全佐剂乳化的ZnuA蛋白，每只100 μL。1周后，实验组和对照组分别腹腔接种108 cfu的05ZYH33各1 mL。

图 1

注: M: 250 bp DNA Marker;1: 1/2血清型;2～6: 1～5血清型;7 ～ 11: 7～11血清型;12～33: 12～33血清型;34:阴性对照;35: 7996 株;36: T15株;37: HAbb株;38: 98012株;39: HA68株。 图 1不同血清型S.suis的znuA基因分布

PCR扩增结果显示，在所有被检的菌株中，除血清型17、21和30型菌株及荷兰分离株T15菌株外，其他30个血清型S.suis菌株、 7996菌株以及4株S.suis 2型国内分离菌株基因组中均扩增到837 bp目的条带，表明znuA基因广泛存在于大多数血清型S.suis中。

图 2

注: 1:蛋白Marker;2:细菌05ZYH33蛋白。 图 2细菌蛋白免疫印迹

采用Western blot检测菌体ZnuA蛋白，结果显示，05ZYH33细菌蛋白能与兔抗ZnuA蛋白血清发生反应，在蛋白分子量大小约为36 000 Da处有1条明显条带，表明05ZYH33细菌蛋白与兔抗ZnuA蛋白的血清能发生特异性反应，ZnuA是一个05ZYH33菌体中表达的蛋白。

图 3

注: A:未标记对照S.suis 2采集图;B:未标记对照S.suis 2 平均荧光强度;C:兔阴性血清标记S.suis 2平均荧光强度; D:兔抗ZnuA血清标记S.suis 2平均荧光强度。 图 3 ZnuA的流式细胞术定位

采用流式细胞术对ZnuA蛋白进行细胞定位。结果显示，兔抗ZnuA血清标记S.suis 2的平均荧光强度明显高于兔阴性血清标记S.suis 2和未标记对照S.suis 2的平均荧光强度，表明ZnuA是一个存在于S.suis 2菌体表面的蛋白。

在接种10⁸ cfu 05ZYH33菌12 h后，对照组小鼠死亡8只，ZnuA重组蛋白免疫小鼠死亡1只;24 h后，对照组小鼠全部死亡，死亡率100%;ZnuA重组蛋白免疫小鼠死亡4只，死亡率40.00%，其余生存状态良好，存活＞ 7 d。2组小鼠24 h存活率差异有统计学意义(P ＜ 0.001)。表明ZnuA重组蛋白对Balb/c小鼠有一定免疫保护作用，可作为S.suis亚单位疫苗的侯选分子。

研究表明，虽然青霉素能够成功治疗大部分S.suis感染病例，但越来越多S.suis青霉素抗性菌株被分离出来，而且长期使用抗生素会使一些S.suis菌株产生抗药性[2，6-8]，因此研制疫苗是控制S.suis感染的重要手段。目前尚无人用猪链球菌疫苗，甚至也无有效的可用于猪的疫苗。本课题组近年来在猪链球菌疫苗的研究方面进行了一系列工作，发现了一些具有免疫保护作用的猪链球菌菌体蛋白分子^{〔9,10,11,12,13〕}。

猪链球菌ZnuA是新近发现的具有亚单位疫苗开发前景的细菌表面蛋白^〔4,5〕。通过对S.suis 2中国强毒株05ZYH33进行全基因组序列测定并进行基因组功能注释，生物信息学分析发现基因组中的含有高亲和力锌ABC转运蛋白组分编码基因znuA(Ssu05_2086)。同源比对发现，该编码基因与多种细菌的锌ABC转运蛋白编码基因具有较高的序列同源性^〔5〕。韩明月^〔4〕从S.suis 2中国强毒株05ZYH33中克隆表达出ZnuA重组蛋白，并利用His亲和层析获得较高纯度的蛋白，Western blot分析结果证实，ZnuA重组蛋白与S.suis 2感染猪恢复期血清能发生特异性反应，表明ZnuA具有良好的免疫原性，是一种在S.suis 2感染过程中表达的蛋白。本研究结果表明，znuA基因广泛存在于不同血清型的S.suis中，ZnuA是不仅是一个S.suis 2菌体中表达的蛋白，还是是一种菌体表面蛋白。动物免疫实验结果表明，ZnuA重组蛋白对Balb/c小鼠具有良好的免疫保护作用，ZnuA可作为一个亚单位疫苗候选分子。本研究为进一步研究ZnuA在S.suis致病过程中的作用机理以及S.suis疫苗的研究提供依据。