急性暴露于缺氧环境会给机体带来严重危害,耐缺氧保 健食品能提高机体对缺氧的适应能力而减少损伤。目前对耐 缺氧保健功能的评价采用动物实验,但周期长,实验动物非常 痛苦,且需要动物的量也较大。近年来,国际上提倡“ 3R”原 则,即在实验中尽可能减少动物的使用量,而用组织细胞、各 种体外试验等方法替代动物实验^{[1, 2]}。本研究采用体外细胞 培养技术,以某保健食品为例,将体外培养的小鼠大脑皮质神 经元缺糖/缺氧模型用于耐缺氧保健食品的体外评价。

N eurobasa l^TM培养基、B27培养基、胎牛 血清培养液( DMEM )、胰酶(美国G ibco公司); 胎牛血清( 杭 州四季青生物工程有限公司); 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT,美国 S igm a公司); 连二亚硫酸钠( Na₂S₂O₄ ) 与其他试剂均为国产 分析纯; 乳酸脱氢酶( LDH ) 试剂盒( 北京中山生物科技有限 公司); 超氧化物歧化酶( SOD)试剂盒(南京建成生物制品有 限公司); 市售保健食品(主要活性成份为牛磺酸,浓度为 93% )。2424- 2 型二氧化碳培养箱( 美国She ldon 公司); ZE ISS XDP-12倒置显微镜( 德国ZE ISS 公司); VL5BS超净工 作台、V ersaM ax酶标仪(美国M o lecular Dev ice公司)。

KM 种雄性小白鼠68只,SPF级[广东省实 验动物中心,动物生产许可证号: SCXK ( 粤) 2003- 0002号, 质量合格证编号: 0032172],6~ 8周龄,体重18~ 22 g。使用 常规颗粒饲料(广东省实验动物中心) 饲养于SPF级动物实 验室,室温为( 22 ± 2) ℃ ,湿度为60% ~ 80%。 1.3 方法 1.3.1 牛磺酸复合制剂对小鼠急性脑缺血性缺氧体外模型建立

随机选取48只小鼠随机分成4组: 纯水对照组、牛磺 酸复合制剂高、中、低剂量组[剂量分别为0. 50、0. 17、 0. 08 g /( kg⋅ bw)],每组12只。高、中、低剂量组按设计剂量 每日经口灌胃给予牛磺酸复合制剂1次,纯水对照组按同等 容量灌胃给予纯净水,连续30 d。末次灌胃1 h后,各组动物 自颈部逐只断头,立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停 止时间。

剩余20只小鼠随 机分成4组,每组5只。分组与给予剂量同1. 3. 1,连续5 d, 空白对照组按同等容量灌胃给予纯净水,制备空白血清对照。 末次灌胃后1 h,采眼血,室温静置1 h,3 000 r /m in 离心 15 m in,分离血清,将每组小鼠的血清混匀,各组血清经 0. 22 μm滤膜过滤灭菌,- 20 ℃ 保存备用。

在 文献^[3]方法基础上,本研究使用新生1~ 2 d的小鼠,以自制 鼠尾胶原包被培养板,胎盘蓝染色进行细胞活性鉴定,细胞活 性> 90%即用于实验。

将神经 元分为6组,分别为正常对照组(不进行缺氧/缺糖处理)、缺 糖/缺氧模型组、含牛磺酸复合制剂小鼠的血清高、中、低3个 剂量组和空白血清对照组。将培养至第8 d的神经元弃去原 培养液,换以无血清培养基,3个剂量组及空白血清对照组分 别加入制备好的小鼠血清,体积分数为20%,孵育24 h后,正 常对照组用Eag le' s液( 含10 mmmo l/L葡萄糖)洗2次后每 孔再加1 mL继续培养,其他各组用无糖Eag le' s液洗2次后, 每孔加入含0. 5 mmmo l/L连二亚硫酸钠的无糖E ag le' s液1 mL建立缺糖/缺氧性损伤,作用24 h。

参照LDH 试剂 盒说明收集培养上清液进行测定。

弃去培养液, 用磷酸盐缓冲液( PBS)洗2遍,每孔加入0. 1 m o l/L PBS'0. 05 mm o l/L乙二胺四乙酸二钠盐( EDTA ) ( pH 8. 0 ),再加1% T riton-X100 50 μL,将培养板置振荡器震荡1 m in使之溶解, 加25% H3 PO4 100 μL以沉淀蛋白,3 000 r /m in离心15 m in,取 上清液按SOD试剂盒说明测定。

去除原培养液,用D-H ank’ s洗一 次,换无血清DMEM,每孔加20 μL MTT( 终浓度为5 g /L),37 ℃ 继续培养4 h,弃上清液,每孔加二甲基亚砜100 μL,震荡 10 m in,在酶标仪570、630 nm 测吸光度( A )值,结果以二者差 值表示。

应用SPSS 11. 0软件进行方差分析和t检验。

2. 1 牛磺酸复合制剂对小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间影 响( 表 1) 小鼠给予牛磺酸复合制剂后,与纯水对照组比较, 各剂量组急性脑缺血性缺氧的存活时间均明显延长 ( P ＜ 0. 05)。

表 1 (Table 1)

表 1 牛磺酸复合制剂对小鼠急性脑缺血性缺氧 存活时间影响(x±s) 组别 剂量[g/(kg⋅bw)] 始重(g) 终重(g) 存活时间(s) 纯水对照组 0.00 20.1±0.9 41.3±2.3 15.5±1.2 低剂量组 0.08 20.1±0.9 42.1±1.6 17.3±1.1a 中剂量组 0.17 20.2±0.9 43.2±1.8 19.5±1.2a 高剂量组 0.50 20.2±1.0 42.8±2.2 18.2±0.9a 注: 与纯水对照组比较, aP ＜ 0. 05。

表 1 牛磺酸复合制剂对小鼠急性脑缺血性缺氧 存活时间影响(x±s)

伤影响(表 2) 神经元经连二亚硫酸钠的无糖Eag le' s液培 养后,与正常对照组比较,培养上清液中LDH 活力明显升高, SOD活力与细胞生存率均明显降低( P ＜ 0. 05),表明神经元 缺糖/缺氧模型成功建立。与空白血清对照组比较,含牛磺酸 复合制剂的小鼠血清中、高剂量组神经元LDH 活力明显降低 ( P ＜ 0. 05) ,含牛磺酸复合制剂小鼠血清各剂量组SOD活力 与生存率均明显升高( P ＜ 0. 05)。

表 2 (Table 2)

表 2 含牛磺酸复合制剂对小鼠血清皮质神经元 缺糖/缺氧性损伤影响(n= 6,x±s) 组 别 LDH 活力[U/(g p⋅rot) ] SOD活力[U/(mg⋅p rot) ] 生存率(%) 正常对照组 4.15±1.09 4.98±0.56 100.00±7.35 缺糖/缺氧模型组 14.71±1.71a 3.58±0.44a 68.36±7.73a 空白血清对照组 8.27±1.54 5.57±0.89 75.74±7.00 低剂量血清组 6.96±1.08 6.83±0.65b 90.06±9.73b 中剂量血清组 5.97±0.85b 6.95±0.68b 89.04±6.98b 高剂量血清组 5.68±1.55b 7.55±0.82b 91.92±12.89b 注: 与正常对照组比较, a P ＜ 0.0 5; 与空白血清对照组比较, b P < 0. 05。

表 2 含牛磺酸复合制剂对小鼠血清皮质神经元 缺糖/缺氧性损伤影响(n= 6,x±s)

本研究结果表明,小鼠大脑皮质神经元经连二亚硫酸钠 合并缺糖培养后,上清液中LDH 活力明显升高,表明缺氧造 成神经元细胞膜通透性增加; 细胞的生存率与SOD活力降 低,表明本实验缺氧/缺糖模型建立成功。给予含牛磺酸复合 制剂的小鼠血清后,中、高剂量组LDH 活力明显降低,含牛磺 酸复合制剂小鼠血清各剂量组SOD 活力与细胞生存率均明 显升高,表明该保健食品对神经元缺糖/缺氧损伤具有一定的 保护作用。随着“ 3R”原则逐渐被科学界接受,体外实验替代 整体实验是国际上安全性评价的趋势。本研究通过对皮质神 经元的缺糖/缺氧培养模拟体内缺血性缺氧损伤,建立缺血性 缺氧的体外评价方法,结果表明本方法是可行的。在此基础 上,可探讨神经元单纯缺氧培养、化学性缺氧(如在培养基中 加入耗氧剂)用以模拟实验动物的常压缺氧与化学性缺氧等 情况^[4],探索建立保健食品耐缺氧功能的体外评价方法。